SCN9A基因突變與癲癇的相關性

伍明剛 張 昭 李新宇 左松林 王菊麗 朱金玲 張金波

(佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

SCN9A基因突變與癲癇的相關性

伍明剛 張 昭 李新宇 左松林 王菊麗1朱金玲2張金波2

(佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討SCN9A基因rs6746030位點與癲癇疾病發病的相關性。方法 從醫院隨機選取中央顳區棘波兒童良性癲癇(BECT)組78例和原發性未分類癲癇組82例，以正常人(無癲癇發作史且家族其他上下三代親屬中無癲癇發作史)32例血液作為對照組，提取全血DNA，以PCR擴增、酶切、電泳、測序等技術確定堿基序列及基因分型。運用χ2檢驗計算該基因型與癲癇發病相關性。結果 對照組與疾病組均為平衡群體(P>0.05)；SCN9A基因rs6746030位點與BECT癲癇發病存在相關性(P=0.006 3)；SCN9A基因rs6746030位點與未分類癲癇相關(P=0.012 0)。結論 SCN9A基因rs6746030位點突變與癲癇發病具有相關性。

癲癇；基因突變；SCN9A

癲癇是大腦神經元突發性異常放電導致短暫大腦功能障礙的一種慢性疾病。遺傳學與生物學研究〔1，2〕表明，神經元細胞核中編碼離子通道的基因突變導致膜通道蛋白改變引起通道性質與結構的變化與癲癇發病關系密切，其中包括SCN9A〔3〕參與編碼的電壓門控性鈉離子通道蛋白〔4，5〕。鈉離子通道的打開與關閉能控制細胞電流的變化，在調整大腦神經元放電過程中有主要作用。本文旨在探討SCN9A與癲癇發病的相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象 經同意采取癲癇患者血液標本，選取從2012～2015年，佳木市中心醫院中央區棘波兒童良性癲癇(BECT)組78例和未分類癲癇組82例，篩選正常人32例血液作為對照組不做性別統計。未分類癲癇組入選標準為在醫院確診為腦部異常放電引起癲癇的病人。 PCR引物設計：根據美國國立生物信息中心NCBI給予的rs6746030基因序列，由上海生工公司設計引物。引物序列：正向引物5′-GTGGTCCTTTGGACAACAGC-3′，反向引物5′-TGGTTGAGGGAGTATCACAGAA-3′，PCR擴增產物長為477 bp，經酶切以后所得酶切產物分別為144 bp和333 bp。

1.2 外周血DNA提取 經DNA提取試劑盒(BioTeKe全血基因組提取試劑盒)提取DNA后保存于-20℃冰箱內。

1.3 PCR擴增 反應體系為15 μl。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，72℃終末延伸5 min，循環30次。

1.4 酶切 rs6746030位點的酶切酶為FastDigest Csp6I，試劑添加為Csp6I 0.8 μl；緩沖液1.6 μl；三蒸水13.6 μl，將16 μl混合液混入8 μl DNA 產物中，37℃水浴5 min后80℃水浴滅活10 min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳及測序 2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓150 V，時間45 min，紫外線凝膠成像分析系統進行基因分型。隨機選取不同基因型個體DNA標本寄送中國上海生物工程股份有限公司對其進行測序。

1.6 統計學方法 采用SPSS11.0軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1 Hardy-Weinber平衡分析 各實驗組均滿足Hardy-Weinberg平衡，P>0.5，所以選取的各組標本為遺傳平衡群體，見表1。病例組與對照組間等位基因頻率有統計學意義，見表2、表3。

2.2 SNP位點測序結果圖和酶切凝膠電泳圖

2.2.1 SNP位點測序結果圖 在所有結果中只見G/A與G/G兩種基因型，未見A/A型突變，見圖1。

2.2.2 酶切結果 見圖2。

表1 各組等位基因的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(n)

自由度λ=2

表2 BECT組與對照組的rs6746030位點的基因型及 等位基因頻率分布比較〔n(%)〕

G/G為野生純合子，G/A為突變雜合子，A/A為突變純合子，下表同

表3 癲癇組與對照組的rs6746030位點的基因型及等位基因頻率分布比較(%)

圖1 SNP位點測序結果圖

Y：原樣；GG：野生純合子G/G；GA：突變雜合子G/A；未見突變純合子A/A型圖2 酶切結果

3 討 論

癲癇是神經系統的常見病之一，癲癇的家族聚集現象顯示其發病具有遺傳性，與癲癇有關的基因已被準確定位〔6〕。癲癇發病可以分為原發性癲癇和繼發性癲癇，其中繼發性癲癇往往繼發于腦部內外傷、神經系統寄生蟲感染、腦血管病、腫瘤、遺傳代謝、神經系統藥物中毒等。原發性癲癇為腦部異常放電引起身體肌肉癇樣痙攣，臨床上診斷只能依靠詢問病史、腦電圖檢查等，到目前為止未發現能對原發性癲癇發作有聯系的實質性損傷。近年來研究表明，癲癇的發病與離子通道的改變有關〔7〕，染色體19q13.1的基因SCN1B(編碼電壓型門控鈉離子通道的β1調節亞基)的點突變導致GEFS+，表明電壓型門控鈉離子通道的改變能誘發癲癇。電壓性門控鈉離子〔8〕通道蛋白中αⅠ、αⅡ、β1、β2、α9蛋白分別由SCN1A、SCN2A、SCN1B、SCN2B和SCN9A基因編碼表達，其中SCN9A基因在GEFS+家族中的I62V、P149Q突變〔9〕，SCN9A突變還被發現與SCN1A突變共同存在于SMEI家族中，說明SCN9A基因突變能誘發癲癇，但SCN9A基因具體堿基的突變與癲癇發病相關性及該基因突變的致病機制研究報道很少。研究SCN9A基因突變與原發性癲癇之間相關性，可以豐富原發性癲癇病因學內容。

SCN9A基因在檢測中未發現突變純合子A/A的類型，可能

因為G突變為A的概率為0.109/237(GenBank數據)，突變率低，但是不排除純在野生純合子A/A型基因，故統計時每個基因組數據都加0.5后進行統計。SCN9A基因中rs6746030位點上野生純合子G/G突變成雜合子A/G后可能引起BECT發病，G向A突變可能與BECT發病有關；同樣的，SCN9A基因中rs6746030位點上野生純合子G/G突變成雜合子A/G后可能引起大多數原發性癲癇發病，G向A突變可能與大多數原發性癲癇發病有關。

編碼電壓型門控鈉離子通道蛋白基因突變誘發很多癲癇綜合征，大多數〔10〕突變發生在SCN1A基因上，對SCN9A基因突變導致癲癇發病的報道少，本研究對SCN9A基因突變引發癲癇在病因學上做了補充，但是由于標本量小，標本采集地域局限，所以該研究只針對佳木斯地區有一定的意義，研究還待進一步深入，探索人類SCN9A基因與癲癇的關系。

1 李玉娟，柳垂亮，王 飛，等.異氟醚和七氟醚對新生大鼠皮質凋亡以及Akt和Bcl-x/Bad表達的不同影響〔J〕.中山大學學報(醫學科學版)，2011；32(3)：291-6.

2 Engel T，Henshall DC.Apoptosis，Bcl-2 family proteins and caspases：the ABCs of seizure-damage and epiletogenesis〔J〕?Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol，2009;1(2)：97-115.

3 孫賀東，資曉宏.SCN9A基因研究進展〔J〕.國際遺傳學雜志，2009；32(1)：27-31.

4 向 林，楊 青.特發性癲癇離子通道基因的研究進展〔J〕.重慶醫科大學學報，2007；32(1)：106-9.

5 Chang BS.Lowenstein dh epilepsy〔J〕.N Engl J Med，2003；349(13)：1257-66.

6 張 鑫，譚啟富，武建國.癲癇與基因〔J〕.立體定向和功能性神經外科雜志，1998；11(3)：56-8.

7 肖 波，江利敏.癲癇的發病機制〔J〕.臨床內科雜志，2004；21(9)：577-80.

8 陳程潔，周 桃，云 慧，等.電壓門控鈉離子通道疾病的研究進展〔J〕.現代生物醫學進展，2013；13(30)：5995-6000.

9 宋延民，龍莉莉.電壓門控性鈉離子通道與癲癇〔J〕.中華臨床醫師雜志(電子版)，2011；5(11)：3262-4.

10 劉 超.SCN1A基因突變的致癇機制研究〔D〕.廣州：廣州醫學院，2011.

〔2016-03-11修回〕

(編輯 李相軍)

2015年黑龍江省大學生創新創業訓練計劃指導項目(201510222043)；佳木斯大學創新團隊項目(CXTDPY-201602)；佳木斯大學青年基金項目 (Sq2012-38)

張金波(1974-)，女，副教授，碩士生導師，主要從事遺傳病的診斷、治療與預防研究。

伍明剛(1992-)，男，2012級臨床醫學在讀學生，主要從事臨床醫學研究。

R742.1

A

1005-9202(2017)03-0623-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.043

1 佳木斯市中心醫院 2 佳木斯大學基礎醫學院