穩定轉染hSOD1-G93A基因的肌萎縮側索硬化細胞模型的建立

李學松 王愛華 蘇全平 王 龍 陸玉成 于繼徐，4

(臨沂市人民醫院神經內科，山東 臨沂 276000)

穩定轉染hSOD1-G93A基因的肌萎縮側索硬化細胞模型的建立

李學松1王愛華2蘇全平3王 龍3陸玉成3于繼徐3，4

(臨沂市人民醫院神經內科，山東 臨沂 276000)

目的 建立穩定轉染hSOD1-G93A真核表達載體肌萎縮側索硬化細胞模型。方法 進行NSC-34細胞的培養，利用脂質體方法把已經構建好的pcDNA3.1(-)、hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)和hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質粒轉染至NSC-34細胞系中，再通過G418篩選建立穩定表達hSOD1基因的NSC-34細胞系；以RT-PCR法鑒定轉染后hSOD1在NSC34細胞系中的表達。結果 轉染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質粒的細胞與正常NSC-34細胞相比，胞體變圓，突起減少，且軸突變短。而轉染pcDNA3.1(-)和hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)質粒的細胞較正常NSC-34細胞無明顯變化。RT-PCR法鑒定結果顯示，轉染hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)和hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質粒的細胞中hSOD1基因表達為陽性，而正常NSC-34細胞和轉染pcDNA3.1(-)質粒的對照組為陰性。結論 成功獲得可穩定表達hSOD1-G93A基因的肌萎縮側索硬化細胞模型。

hSOD1-G93A基因；肌萎縮側索硬化；細胞模型

肌萎縮側索硬化(ALS)以大腦運動皮層、腦干運動神經核和脊髓前角運動神經元丟失為特征〔1～3〕。目前該病發病機制尚不明確。至今尚無有效的治療方法阻止該病的進展，該病確診后平均生存3～5年〔4，5〕。因此，建立合適的疾病模型對于研究ALS的發病機制和治療方法具有重要的意義。研究表明，20%家族性ALS(fALS)和少數散發性ALS是由于銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變所致〔6～8〕。SOD1是一種重要的氧自由基清除劑，可以保護機體免受氧化損傷〔9〕。Rosen等〔10〕發現fALS與SOD1基因突變有關，SOD1-G93A基因是SOD1基因序列中第281位的G突變為C，引起蛋白序列中第93位的甘氨酸(G)突變為丙氨酸(A)。我們前期已經應用重疊區擴增基因拼接法構建含點突變的hSOD1-G93A基因的真核表達載體〔11〕。本研究建立穩定轉染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 真核表達載體的ALS細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 鼠運動元樣細胞系(NSC-34)由河北醫科大學神經病學實驗室惠贈；pcDNA3.1(-)、hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)、hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質粒和DH5α本實驗室保存；綠色體系和反轉試劑盒購自美國Fermentas公司；限制性內切酶購自美國NEB公司；脂質體LipofectamineTM 2000、Trizol試劑和G418購自美國Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒(Fermentas)；DMEM培養液和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；SMI-32一抗購自美國Covance公司；免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 NSC-34細胞的培養 將NSC-34細胞從液氮中取出，置于37℃水浴箱中迅速融化，然后轉移至離心管中，加入5 ml含10% FBS的DMEM完全培養基，混勻，接種于25 cm2玻璃培養瓶中。將培養瓶蓋旋至半松狀態，置于37℃、5%CO2條件的培養箱內培養，每2～3天更換一次培養液。

1.3 NSC-34細胞的轉染和篩選培養 將處于對數生長期的NSC-34細胞以每孔4×104密度接種于6孔培養板，培養24 h〔12〕。在細胞達到50%～70%融合時，用脂質體LipofectamineTM 2000介導pcDNA3.1(-)、hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)和hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質粒轉染NSC-34細胞。轉染前1 h先將細胞培養液更換成無血清DMEM培養液。然后準備以下2種溶液，A液：4 mg質粒DNA溶于150 ml無血清DMEM培養液中；B液：10 ml脂質體溶于150 ml無血清DMEM培養液中。將A液與B液分別于室溫靜置5 min，混勻后再室溫孵育20 min，加入DMEM培養液中。培養4～6 h后，更換為含血清DMEM完全培養液，繼續培養24 h，次日加入400 mg/L的G418進行選擇培養，1 w后G418濃度降為200 mg/L維持篩選〔12〕。2 w后，分離陽性克隆并擴大培養，然后再用600 mg/L的G418持續篩選2 w，收集最終的陽性克隆并擴大培養，備用。

1.4 細胞免疫組化 將細胞消化、離心重懸后，按2×104/ml的密度將細胞接種于6孔板上進行細胞爬片，培養箱內培養24 h后取出，4%多聚甲醛固定40 min，1%TritonX-100浸透20 min，3%H2O2孵育10 min，然后滴加封閉血清工作液孵育15 min，阻斷非特異性染色，用稀釋好的一抗4℃過夜。次日加生物素標記的IgG(1∶1 500)，37℃孵育15 min，鏈霉親和素-HRP工作液37℃孵育15 min，DAB顯色1～10 min，梯度酒精脫水、二甲苯透明、明膠樹脂封片。用PBS替代一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.5 RT-PCR法鑒定轉染hSOD1細胞的mRNA 應用Trizol試劑提取轉染前后細胞總RNA，取2 μg進行逆轉錄。cDNA第一鏈的合成是根據cDNA第一鏈合成試劑盒說明書推薦步驟操作完成，產物于-20℃保存。采用25 μl的PCR擴增體系，包括：綠色體系12.5 μl、上下游引物各0.5 μl、樣本cDNA模板0.5 μl和無菌超純水10.5 μl。人SOD1(hSOD1)引物序列：上游5′-CGTTTAAACGGGCCCTCTAGAGCCGCCACCATGGCGACG AAGGCCGTGTGCG-3′，下游5′-CAGCGGTTTAAACTTAAGCTTTTAGTGATGGTGGTGATGGTG-3′。反應條件：94℃預變性5 min，進入循環94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃30 s，循環30次，72℃延伸10 min，4℃終止。鼠SOD1引物序列：上游5′-ATCGGCAGGGAACCATCCACTT-3′，下游5′-ATCGTGCCCAGGTCTCCAACAT-3′。反應條件為：預變性94℃ 5 min；進入循環94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，循環30次，72℃延伸10 min，4℃終止。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增出目的基因片段，每個樣本重復3遍。

2 結 果

2.1 NSC-34細胞轉染和篩選后細胞形態學 轉染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質粒的細胞與正常NSC-34細胞相比，胞體變圓，突起減少，且軸突變短。而轉染pcDNA3.1(-)和hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)質粒的細胞較正常NSC-34細胞無明顯變化。見圖1。

Normal：正常NSC-34細胞；Empty：轉染空質粒pcDNA3.1(-)的NSC-34細胞；hSOD1-WT：轉染hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)質粒的NSC-34細胞；hSOD1-G93A：轉染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質粒的NSC-34細胞圖1 NSC-34細胞轉染和篩選后細胞形態學(×200)

2.2 RT-PCR鑒定結果 應用人SOD1(hSOD1)引物進行RT-PCR，結果顯示正常細胞組和轉染空載體細胞組未見陽性條帶，穩定轉染hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)和hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質粒的NSC-34細胞組可見陽性條帶(圖2)。應用鼠SOD1(mSOD1)引物進行RT-PCR，結果顯示四組都出現了mSOD1基因的陽性條帶(圖2)。因此可以證明hSOD1基因成功轉入NSC3-4細胞系中。

M：DNA2 000 bp ladder Marker；1：正常NSC-34細胞；2：轉染空質粒pcDNA3.1(-)的NSC-34細胞；3：轉染hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)質粒的NSC-34細胞；4：轉染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質粒的NSC-34細胞，下圖同圖2 hSOD1及mSOD1引物RT-PCR結果

3 討 論

目前ALS發病機制尚不明確，并且無有效的治療方法，因此建立良好的疾病模型對于本病的研究具有重要的意義。在許多ALS家系中發現SOD1基因突變〔13〕，約20%的 ALS與SOD1基因突變有關〔6～8〕。研究發現在ALS腦脊液和組織中氧自由基和異常自由基代謝產物增多，推測由于SOD1基因突變將導致抗氧化能力喪失，機體對自由基解毒能力下降〔14〕。研究發現在SOD1突變的動物脊髓中，抗凋亡蛋白Bcl-2結合有突變SOD1陽性的成分，而在肝臟中則未發現類似的表現，提示突變的SOD1可能通過促進凋亡導致運動神經元死亡〔15〕。突變產生的SOD1蛋白具有獲得性毒性功能，損傷神經元的結構和功能，加劇細胞氧化應激損傷反應，SOD1基因突變產生的SOD1蛋白異常折疊而形成蛋白質的異常聚集可能啟動ALS的發生〔16，17〕。NSC-34細胞是一種雜交細胞系，由富有運動神經元的胎鼠脊髓細胞和小鼠神經母細胞瘤細胞融合而成。NSC-34細胞具有許多運動神經元特性，例如具有膽堿乙酰轉移酶性質，具有乙酰膽堿合成特性，具有貯存和釋放神經纖絲三聯體蛋白質的特性。因此，NSC-34細胞作為運動神經元樣細胞多用于研究神經毒性方面的模型。我們實驗室已經熟練培養和貯存NSC-34細胞系。

本研究顯示hSOD1基因成功轉入NSC3-4細胞系中，從而獲得穩定轉染hSOD1基因的ALS細胞模型。細胞模型干擾因素較少，對于研究疾病的發病機制，以及藥物作用機制具有較大的優勢。本研究成功獲得了可穩定表達人SOD1基因的NSC34細胞系，為進一步系統研究ALS發病機制和治療方法奠定了實驗基礎。

1 Boillée S，Vande Velde C，Cleveland DW.ALS：a disease of motor neurons and their nonneuronal neighbors〔J〕.Neuron，2006；52(1)：39-59.

2 Mitchell JD，Borasio GD.Amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Lancet，2007；369(9578)：2031-41.

3 Kiernan MC，Vucic S，Cheah BC，etal.Amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Lancet，2011；377(9769)：942-55.

4 Zinman L，Cudkowicz M.Emerging targets and treatments in amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Lancet Neurol，2011；10(5)：481-90.

5 劉小璇，樊東升，張 俊.肌萎縮側索硬化患者106例生存分析〔J〕.中華神經科雜志，2009；42(6)：402-5.

6 齊 新，崔麗英.SOD1基因與運動神經元病相關性的研究進展〔J〕.中國實用內科雜志.2009；29(5)：417-20.

7 Chattopadhyay M，Valentine JS.Aggregation of copper-zinc superoxide dismutase in familial and sporadic ALS〔J〕.Antioxid Redox Signal，2009；11(7)：1603-14.

8 Liscic RM，Breljak D.Molecular basis of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2011；35(2)：370-2.

9 高春林，王浙東，殷偉平，等.癲癇大鼠海馬超氧化物歧化酶與一氧化氮關系的研究〔J〕.醫學研究生學報，2003；16(2)：108-10.

10 Rosen DR，Siddique T，Patterson D，etal.Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Nature，1993；362(6415)：59-62.

11 陸玉成，車峰遠，蘇全平，等.應用SOEing方法構建SOD1-G93A的真核表達載體〔J〕.天津醫藥，2013；41(12)：1208-10.

12 張曉燕，盧 葦，張巧霞，等.小鼠雄激素受體真核表達載體的構建與鑒定〔J〕.生殖與避孕，2012；32(1)：1-4.

13 Gruzman A，Wood WL，Alpert E，etal.Common molecular signature in SOD1 for both sporadic and FALS〔J〕.Proc Nat Acad Sci USA，2007；104(30)：12524-9.

14 方登福，曾 艷.散發性肌萎縮側索硬化遺傳學研究進展〔J〕.華西醫學，2011；26(4)：629-31.

15 Tan W，Naniche N，Bogush A，etal.Small peptides against the mutant SOD1/Bcl-2 toxic mitochondrial complex restore mitochondrial function and cell viability in mutant SOD1-mediated ALS〔J〕.J Neurosci，2013；33(28)：11588-98.

16 Bastow EL，Gourlay CW，Tuite MF.Using yeast models to probe the molecular basis of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Biochem Soc Trans，2011；39(5)：1482-7.

17 Appel SH，Zhao W，Beers DR，etal.The microglial-motoneuron dialogue in ALS〔J〕.Acta Myol，2011；30(1)：4-8.

〔2015-09-25修回〕

(編輯 曹夢園)

山東省自然科學基金(ZR2010HM041)；山東省博士后創新項目專項資金(201102004)

于繼徐(1974-)，男，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事神經變性病研究。

李學松(1967-)，男，副主任醫師，碩士，主要從事腦血管病、神經系統變性病等。

R741.02

A

1005-9202(2017)03-0569-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.019

1 臨沂衛生學校 2 臨沂市人民醫院消化內科

3 臨沂市人民醫院中心實驗室 4 臨沂市人民醫院神經內科