北京鴨BNIP3L基因CDS區(qū)克隆及序列分析

（四川省達(dá)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川達(dá)州635000）

北京鴨BNIP3L基因CDS區(qū)克隆及序列分析

甘偉，任小春，任小松

（四川省達(dá)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川達(dá)州635000）

BNIP3L定位于線粒體，廣泛分布于各個(gè)組織中，具有促凋亡的作用。根據(jù)NCBI上鴨BNIP3L基因預(yù)測序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)，對鴨BNIP3L基因CDS區(qū)序列進(jìn)行克隆。結(jié)果表明：擴(kuò)增出BNIP3L基因的CDS區(qū)序列全長為543bp，編碼180個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為19.52 ku，理論等電點(diǎn)為6.334。另外，該氨基酸序列存在典型的3個(gè)低密度區(qū)域和1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn)鴨的BNIP3L基因具有特有的保守序列，而且與鳥類的BNIP3L基因具有較高的相似性，并對其氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，整個(gè)多肽鏈中疏水性氨基酸為151個(gè)，親水性氨基酸為29個(gè)，因此整個(gè)多肽鏈應(yīng)為疏水性。其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，分別占22.78%、7.22%、17.78%和52.22%。以上數(shù)據(jù)表明北京鴨BNIP3L基因CDS區(qū)序列與安氏蜂鳥、朱鹮、雞具有較高的一致性，且在物種進(jìn)化過程中較為保守。

北京鴨；BNIP3L；基因克隆；序列分析

BNIP3L最早是從人胎肝cDNA文庫中克隆得到的，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，mRAN全長1 337 bp，屬Bcl-2家族中的BH3-only亞家族，是BNIP3的同族體，定位于線粒體且在人體各組織中均有表達(dá)［1］。近年來，BNIP3L基因在癌細(xì)胞中的研究已引起廣泛關(guān)注。在前列腺癌組織研究中發(fā)現(xiàn)，BNIP3L主要分布于胞漿中，其較正常的前列腺組織表達(dá)增加，進(jìn)一步對BNIP3L表達(dá)與前列腺癌患者的臨床因素進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)BNIP3L的表達(dá)與患者總生存率的降低顯著相關(guān)。即BNIP3L可通過調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而參與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)，BNIP3L定位于8p21肺癌高頻雜合性丟失區(qū)，能與Bcl-2、EBI9K等抗凋亡蛋白相互作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［2］。

鑒于BNIP3L基因在細(xì)胞發(fā)育過程中具有重要調(diào)控作用，通過從分子角度分析其結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而為遺傳育種在分子水平上進(jìn)一步發(fā)展奠定基礎(chǔ)。該研究采用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增出北京鴨BNIP3L基因CDS區(qū)序列，利用現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行序列分析，探討其與其他物種之間的親緣關(guān)系，以期為全面揭示北京鴨BNIP3L基因的蛋白表達(dá)和功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 擴(kuò)增引物

目前，NCBI上綠頭鴨的BNIP3L基因CDS區(qū)序列（登錄號(hào)：XM_005024485），用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物由北京華大生物技術(shù)公司合成。

1.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取北京鴨（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水禽育種場提供）腿肌肌肉組織樣，置于液氮中冷凍并進(jìn)行研磨。取100mg研磨好樣品用Trizol法提取鴨腿肌的總RNA。采用Prime Scrip RT reagent Kit的mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，-20℃保存。

1.3 目的片段PCR擴(kuò)增

以北京鴨cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積為50 μl，其中cDNA為5 μl，上下游引物個(gè)2 μl，PCR Master mix 25 μl，ddH2O 16 μl，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃延伸2 min，34個(gè)循環(huán)，72℃10 min。待反應(yīng)結(jié)束，使用電泳儀進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖濃度一般為1.5%。Gel Extraction Kit膠回收試劑盒（Omega，USA）回收目的片段，將純化后的PCR產(chǎn)物同pMDl9-T（TaKaRa，Japan）載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆菌接種并進(jìn)行搖床培養(yǎng)，菌液PCR鑒定后挑選陽性克隆送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 序列分析

DNAman序列分析軟件將DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列，并對翻譯的序列進(jìn)行分析；多序列比對采用Clustal W（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）軟件。信號(hào)肽查找用Sigal P 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP-3.0/）程序分析。蛋白功能預(yù)測應(yīng)用軟件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）完成。在線軟件（http：// prosite.expasy.org/）預(yù)測氨基酸結(jié)構(gòu)域。采用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分子系統(tǒng)NJ樹，遺傳距離選擇Kimura2-parameter模型，構(gòu)建NJ樹采用重復(fù)抽樣分析1 000次檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹各分支的置信度。應(yīng)用ProtScale程序（http：//expasy.org/cgibin/protscale.pl）進(jìn)行蛋白質(zhì)的疏水性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨BNIP3L基因克隆

根據(jù)GenBank上發(fā)表的鴨BNIP3L基因的CDS區(qū)預(yù)測序列設(shè)計(jì)引物，以北京鴨的腿肌cDAN為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳電壓為180V，電泳10 min，最終得到產(chǎn)物清晰且特異性較好的目的條帶，長度與推算結(jié)果相符。

2.2 鴨BNIP3L基因兩種剪切體測序結(jié)果及氨基酸序列預(yù)測

ORF Finder在線軟件分析，最長開放閱讀框均為543bp，編碼180個(gè)氨基酸，含有起始密碼子和終止密碼子在內(nèi)的完整開放閱讀框（ORF），氨基酸序列不存在信號(hào)肽序列，說明BnIP3編碼的蛋白為非分泌蛋白，相對分子質(zhì)量為19.52 ku，推測的蛋白等電點(diǎn)為6.334。該氨基酸序列存在典型的3個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域和1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.3 鴨BNIP3L基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列同源性分析

運(yùn)用DNAMAN軟件將鴨BNIP3L基因核苷酸和氨基酸序列分別與安氏蜂鳥、朱鹮、斑胸草雀、雞、綿羊、牛、豬、人、家鼠、鯊魚等物種進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明北京鴨BNIP3L的核苷酸序列與各物種的同源性分別為95.76%、95.76%、62.08%、79.17%、60.91%、67.73%、68.79%、68.79%、67.12%、61.45%，氨基酸的同源性分別為98.33%、98.33%、65.41%、82.33%、67.12%、73.52%、73.85%、74.43%、73.39%、60.85%。

2.4 鴨BNIP3L基因的分子進(jìn)化分析

利用MEG5.1軟件，將該試驗(yàn)所得到的鴨BNIP3氨基酸序列與安氏蜂鳥、朱鹮、牛、豬、人、鯊魚等物種進(jìn)行多重序列比對并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。BNIP3L進(jìn)化樹分化為鳥類、哺乳類和魚類三支，其中鴨與鳥類親緣關(guān)系較近，處于進(jìn)化樹同一分支上，而與魚類的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.5 鴨BNIP3L基因蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括無規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈。用ProtScale程序?qū)NIP3L編碼的多肽鏈進(jìn)行親水性分析。正值越大表示該區(qū)域越疏水，負(fù)值越大表示該區(qū)域越親水。位于158位的組氨酸（His）值最高，為2.3，疏水性最強(qiáng)；分別位于10和11位的天冬酰胺（Asn）和甘氨酸（Gly）值最低，為-2.556，親水性最強(qiáng)。整個(gè)多肽鏈中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，預(yù)示著該蛋白可能是親水性的。

3 討論

隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展，育種研究已不再局限于通過表型差異進(jìn)行優(yōu)良性狀的選擇，分子標(biāo)記技術(shù)開始大量的運(yùn)用于現(xiàn)今的育種中。細(xì)胞的凋亡過程是一個(gè)多調(diào)控因子共同參與的過程，BNIP3L可與其他調(diào)節(jié)因子相互作用，共同參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡。研究已表明，作為凋亡家族成員之一，BNIP3L在缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起重要調(diào)控作用，其即可通過激活Caspase信號(hào)通路，也可通過與BAX、BAK、Bcl-2、E1B19K、Bcl-XL等抗凋亡蛋白相互作用，增加線粒體膜通透性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］。檢測4種肺癌細(xì)胞株中BNIP3L的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與HBE4-E6/E7細(xì)胞相比無明顯差異。

BNIP3L編碼蛋白含有凋亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，可與相關(guān)凋亡蛋白相互作用，參與細(xì)胞凋亡過程。而當(dāng)前BNIP3L的研究主要集中在人癌細(xì)胞上，在禽類上鮮有報(bào)道。本研究通過RT-PCR擴(kuò)增了北京鴨BNIP3L基因的CDS序列，并對其序列進(jìn)行了序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)核苷酸序列和氨基酸序列與鳥類的同源性均達(dá)到85%以上，而與人、小鼠、哺乳動(dòng)物及水棲類均達(dá)不到60%，說明北京鴨和鳥類BNIP3L基因在功能上可能相似。通過對北京鴨BNIP3L的編碼區(qū)準(zhǔn)確克隆，可為進(jìn)一步在蛋白水平上分析研究BNIP3L的功能提供理論依據(jù)。

［1］Yasuda M，Han JW，Dionne CA，et al.BNIP3a：AHumanHomologofMitochondrialProapoptotic Protein BNIP3［J］.Cancer Res，1999，59（3）：533-537.

［2］孫繼麗，賀修勝，余艷輝，等.BNIP3L基因在肺癌組織中的表達(dá)及結(jié)構(gòu)分析［J］.基礎(chǔ)研究，2004，23（1）：8-14.

［3］Whitaker-MenezesD1，Martinez-OutschoornUE，F(xiàn)lomenberg N，et al.Hyperactivation of oxidative mitochon?drial metabolism in epithelial cancer cells in situ Visual?izing the therapeutic effects of metformin in tumor tissue［J］.Cell Cycle，2011，10（23）：4047-4064.

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