腎缺血再灌注損傷中蛋白激酶C對巨噬細胞的影響

肖婷綜述容松審校

（遵義醫學院附屬醫院腎內科，貴州遵義563003）

·綜述·

腎缺血再灌注損傷中蛋白激酶C對巨噬細胞的影響

肖婷綜述容松審校

（遵義醫學院附屬醫院腎內科，貴州遵義563003）

缺血再灌注損傷是器官移植不可避免的反應過程，其病理生理機制包括細胞凋亡、氧自由基生成、免疫系統活化、微血管功能障礙等。其中先天免疫是機體防御的第一道防線，也是關鍵環節，而巨噬細胞是腎臟缺血性先天免疫早期重要的起動子，在缺血再灌注損傷中發揮雙劍作用。因此，在早期減輕巨噬細胞的浸潤是目前的研究熱點。而蛋白激酶C抑制劑能通過多途徑作用減少移植腎內的巨噬細胞浸潤，但目前具體機制尚不完全清楚。

腎缺血再灌注損傷；先天免疫；巨噬細胞；蛋白激酶C

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是指組織器官缺血再灌注后其組織細胞代謝障礙，從而導致結構和功能的破壞，是器官移植后不可避免的反應過程，也是移植物失功的主要病理機制，因此如何減輕這種損傷一直是器官移植研究的熱點，也是難點。IRI的病理生理機制復雜，影響因素包括能量代謝障礙、胞內線粒體及胞膜改變、不同形式的細胞死亡、趨化因子、細胞因子等促進炎癥反應發生并導致免疫系統活化，而炎癥的持續存在最終導致移植物進行性纖維化[1]。有觀點認為先天免疫反應是IRI的關鍵部分[2]，了解先天免疫反應及器官移植后同種免疫反應是優化移植物長期結果的關鍵[3]。而巨噬細胞在腎臟缺血再灌注損傷的固有免疫及獲得性免疫中都擁有重要作用[4]。目前認為巨噬細胞至少有兩種表型：經典活化M1型參與促炎反應，選擇性活化M2型參與抗炎反應[5]。因此在損傷早期減少巨噬細胞浸潤，能減輕移植物損傷。查閱相關文獻及本實驗小組前期實驗均發現，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制劑能阻止巨噬細胞向腎間質浸潤，并進一步深入研究發現PKCβ及ε缺失對單核巨噬細胞早期浸潤有阻礙作用[6-7]。但其具體作用機制及是通過巨噬細胞何種亞型對腎損傷產生保護作用尚不明確，有待進一步研究。本文主要將探討PKC對巨噬細胞影響。

1 缺血再灌注損傷的病理生理機制概述

缺血再灌注損傷主要由器官血流動力學受損引起。目前我國器官移植大部分供體來源于尸體，早在供體腦死亡時就已經發生血流動力學紊亂，隨后的器官采集、冷儲藏等都將引起器官缺血，從而導致組織缺氧、能量代謝障礙，乳酸堆積、胞內ATP消耗，Na+-K+ATP酶失活，水鈉潴留，細胞腫脹、溶酶體膜破裂、細胞壞死[2]；同時也導致Ca2+泵失活、鈣超載[8]，鈣依賴的蛋白激酶如鈣激活中性蛋白酶活化。但奇怪的是再灌注后，血流恢復并沒有使之前受損的細胞得到改善，反而加重細胞損傷。可能與再灌注后活性氧(ROS)生成、線粒體失功、內皮功能障礙和免疫系統活化有關。再灌注后線粒體復合物受損，導致過度活性氧生成并超出抗氧化清除能力[9]。反過來，活性氧破壞膜脂質、蛋白質和核酸導致細胞死亡[10]。此外，線粒體滲透性轉換孔(mPTP)接觸活性氧后開放并引起線粒體鈣增加，導致電化學梯度的中斷，解耦聯氧化磷酸化和ATP耗竭，滲透壓增加、線粒體腫脹、膜破裂導致細胞壞死、凋亡[11]。死亡的細胞刺激免疫系統活化，從而介導中性粒細胞、NK細胞、樹突細胞、巨噬細胞等活化并浸入組織釋放炎癥因子，同時模式識別受體(pattern recognition Receptors，PRRs)識別病原體相關分子模式(pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)、補體系統激活產生級聯放大效應，誘導移植物失功[1]。

移植物脈管系統對缺血再灌注損傷也十分敏感[12]，事實上再灌注后缺血組織血流量并不是立即完全恢復，這個過程稱為“無復流現象”，主要由于腎缺血缺氧后血管緊張素[13]、內皮素等縮血管物質生成增加，內皮細胞腫脹及白細胞、纖維蛋白、血小板等在血管內粘附聚集有關。在IRI中，受損活化的內皮細胞也失去了屏障功能，滲透性增加、白細胞遷移[14]。此外，血液流動停止已被證明由于KLF2的減少會導致內皮功能損傷[15]。

最近有研究證實，在IRI期間補體系統經典及凝集素活化途徑均主要發生在內皮細胞層[16]，補體系統的啟動及Akt(serine/threonine-specific protein kinase)途徑活化使得內皮細胞獲得間葉細胞表型，誘導間質纖維化并促進慢性腎臟病的發展[17-18]。

2 巨噬細胞在腎缺血再灌注損傷中的雙劍作用

缺血再灌注所致損傷主要有兩個階段：第一階段在器官移植后迅速發生，與缺血相關性損傷有關；第二階段發生時間相對較晚，與IRI所致免疫系統活化并引起抗體介導和細胞介導的排斥反應有關。而樹突細胞和巨噬細胞是腎臟先天免疫早期重要的起動子，也銜接了炎癥后缺血再灌注損傷的發生[4]。它們是腎臟中最豐富的白細胞，能在再灌注后直接通過促炎因子及其他可溶性炎癥介質調節因子的產生或直接通過效應T淋巴細胞和自然殺傷T細胞誘導炎癥反應[4]。有研究顯示在再灌注30 min內即有中性粒細胞和巨噬細胞進入腎臟，24～48 h內達高峰[4]。通過免疫組織化學染色法檢測到在同種異體移植物排斥反應中，巨噬細胞占浸潤白細胞的38%～60%[19]。

巨噬細胞有兩種主要表型:經典活化M1型和選擇性活化M2型。再灌注24 h后巨噬細胞浸潤明顯增加[20]。在INF-γ及TNF-α誘導下其表型主要表現為M1型，激活后的M1型巨噬細胞促進IL-1、IL-6、IL-23等促炎因子產生，導致炎癥反應及組織損傷[21]；同時高表達誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，iNOS分解精氨酸為瓜氨酸和一氧化氮(NO)，大量生成的NO引起組織損傷[22]。同時M1型巨噬細胞能在IL-6及IL-23刺激下活化輔助性T細胞17(Th17)[21]，Th17是一種新發現的能夠分泌IL-17的T細胞亞群，而IL-17可以促進T細胞激活并刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞等產生多種細胞因子從而導致炎癥的產生。

當巨噬細胞受IL-4誘導時表型轉換為M2型。IL-4或者IL-13通過與其受體IL-14Rα結合激活JAK-STAT6轉導通路[23-24]，調節M2效應子如精氨酸酶-1(Arg-1)等表達上調，而精氨酸酶能與iNOS競爭性結合精氨酸，裂解精氨酸為多胺和脯氨酸，促進細胞分裂和膠原形成，對炎癥后期造成的組織損傷進行修復和重塑[25]。同時M2型巨噬細胞也能通過IL-4/ IL-13刺激誘導產生甘露糖受體(MMR)及IL-10[26]。MMR屬C型凝集素超家族中多糖識別域家族成員，在天然免疫防御發揮重要作用，同時參與抗原提呈、誘導并調控獲得性免疫應答。

3 蛋白激酶C對大鼠巨噬細胞的影響

3.1 蛋白激酶C概述PKC是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族主要成員，它與蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase，PKA)和蛋白激酶G(cGMP-dependent protein kinase，PKG)共同構成絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AGC(PKA、PKG和PKC)超家族。PKC包括至少10個同工酶(原認為12個)[PKCα、βI、βII、γ、δ、ε、η(L)、θ及ζ和λ]，由單一多肽鏈組成，其結構由高度同源性的4個保守區(C1～C4)和低度同源性的5個可變區(V1～V5)組成，可變區在特定PKC同工酶亞型的識別和激活中起作用。正常情況下PKC處于非活化狀態，其依賴于Ca2+、乙酰基甘油、磷脂酰絲氨酸或其類似物佛波酯刺激而激活，催化蛋白質內絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，從而進行信息傳導，是細胞肌醇磷脂信號通路的關鍵環節，在細胞遷移、增殖、凋亡和離子通道調制上均起著重要的作用[27]。其在各組織、器官中均有廣泛表達，在腎臟中表達也非常廣泛，有大量研究表明同工酶α、βI、δ、ε、ζ、λ均能在腎臟中檢測到(PKCβII主要表達于腎間質細胞)[28]，并參與調控腎小球的血流動力學[29]及腎小管[30]、集合管的轉運機制[31-32]。

3.2 蛋白激酶C與巨噬細胞國內外相關文獻及實驗研究結果，表明PKCβ抑制劑能減少巨噬細胞浸潤，從而達到腎保護效應。本課題小組的前期實驗也證實了此觀點，并進一步研究發現PKCβ缺失對單核巨噬細胞早期浸潤有阻礙作用[7]。

有報道在缺血缺氧條件下脂代謝受到阻礙，總膽固醇、二酰甘油增加[33]，增加的二酰甘油刺激PKC活化增加。而激活的PKC能在GM-CSF及IL-4的誘導下刺激CD14+單核細胞分別向巨噬細胞/樹突細胞分化[34]，并與單核細胞初始粘附于血管壁和纖維蛋白原有關，而單核細胞粘附于內皮細胞是血管損傷的第一步。另有研究顯示，巨噬細胞在趨化因子如MCP-1等的趨化下進入腎間質，從而引起小管間質損傷，而骨橋蛋白介導這一趨化作用，PKC則介導骨橋蛋白表達[35]。Lin等[34]的研究已經證實在高糖條件下微血管系統中主要活化的是PKCβ，而PKCβ抑制劑能阻止單核細胞向內皮細胞粘附，顯著改善糖尿病微血管并發癥。同樣Kelly等[35]發現在高糖條件下PKCβ抑制劑也能減少骨橋蛋白的表達，同時能降低MCP-1、ED-1表達[36]，從而抑制巨噬細胞及其他炎性細胞浸潤。另有報道發現巨噬細胞暴露于細菌脂多糖(LPS)時活化PKC，而用各種PKC同工酶抑制劑證實PKC是巨噬細胞許多功能(如IL-1、TNF-α、NO產生及抗腫瘤細胞活性)所必須的，并進一步研究發現主要是PKCβI及βII的活化促進了巨噬細胞中LPS誘導的細胞毒性作用和一氧化氮產生[37]。而Picinich等[38]的實驗表明IL-8信號通路可激活PKC，應用PKC抑制劑可以明顯抑制IL-8的表達[39]，IL-8主要由巨噬細胞和上皮細胞分泌，是一個非常重要的炎癥趨化因子。

綜上所述，PKC抑制劑對巨噬細胞的影響主要有幾個方面：①阻止單核細胞向巨噬細胞分化；②阻止巨噬細胞粘附于血管壁，從而減輕血管損傷；③減少趨化因子表達，從而減少巨噬細胞向阻止浸潤；④降低IL-8等巨噬細胞分泌的炎性因子的表達；⑤直接抑制巨噬細胞誘導的細胞毒性作用。

4 展望

在過去的20年里，已經有大量研究表明在進行性的腎損傷中巨噬細胞起著關鍵作用，在腎缺血再灌注損傷中也不例外。巨噬細胞主要有兩種表型：經典促炎M1型及抗炎M2型。其中M1型的主要損傷機制包括啟動免疫應答、釋放氧自由基、炎癥因子及包括TGF-β1在內的生長因子，其中TGF-β是腎纖維化的關鍵致病因子之一；而M2型主要產生精氨酸酶-1、甘露糖受體及胰島素樣生長因子等，從而促進損傷組織修復。因此，在損傷早期阻止單核巨噬細胞浸潤能顯著改善損傷組織。研究發現PKC在促進單核細胞向巨噬細胞分化，并介導其粘附于血管壁及浸潤腎間質中均發揮不小的作用，同時Wang等[40]研究發現PKC(主要是βI、βII)高表達能上調TGF-β及血管內皮生長因子(VEGF)的表達從而誘導腎間質纖維化，而使用PKCβ抑制劑能阻止單核巨噬細胞的浸潤并下調TGF-β表達，從而達到腎保護效應；這為移植后缺血再灌注損傷的治療提供了新的思路。但其對巨噬細胞的具體影響機制還有待進一步研究。

[1]Salvadori M,Rosso G,Bertoni E.Update on ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation:Pathogenesis and treatment[J].World J Transplant,2015,5(2):52-67.

[2]Slegtenhorst BR,Dor FJ,Rodriguez H,et al.Ischemia/reperfusion injury and its consequences on immunity and inflammation[J].Curr Transplant Rep,2014,1(3):147-154.

[3]Denecke C,Tullius SG.Innate and adaptive immune responses subsequent to ischemia-reperfusion injury in the kidney[J].Prog Urol, 2014,24(Suppl 1):S13-19.

[4]Li L,Okusa MD.Macrophages,dendritic cells,and kidney ischemia-reperfusion injury[J].Semin Nephrol,2010,30(3):268-277.

[5]Rowshani AT,Vereyken EJ.The role of macrophage lineage cells in kidney graft rejection and survival[J].Transplantation,2012,94(4): 309-318.

[6]Rong S,Hueper K,Kirsch T,et al.Renal PKC-ε deficiency attenuates acute kidney injury and ischemic allograft injury via TNF-α-dependent inhibition of apoptosis and inflammation[J].Am J Physiol Renal Physiol,2014,307(6):F718-726.

[7]楊旸,楊亦彬,梁國標,等.蛋白激酶C抑制劑對小鼠腎移植后炎性細胞浸潤的影響[J].中華實驗外科雜志,2015,32(1):202-204.

[8]Roberts BN,Christini DJ.NHE inhibition does not improve Na(+)or Ca(2+)overload during reperfusion:using modeling to illuminate the mechanisms underlying a therapeutic failure[J].PLoS Comput Biol, 2011,7(10):e1002241.

[9]Chen Q,Moghaddas S,Hoppel CL,et al.Ischemic defects in the electron transport chain increase the production of reactive oxygen species from isolated rat heart mitochondria[J].Am J Physiol Cell Physiol,2008,294(2):C460-466.

[10]Jaeschke H,Woolbright BL.Current strategies to minimize hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting reactive oxygen species[J]. Transplant Rev(Orlando),2012,26(2):103-114.

[11]Halestrap AP.What is the mitochondrial permeability transition pore? [J].J Mol Cell Cardiol,2009,46(6):821-831.

[12]Tuuminen R,Syrj?l? S,Krebs R,et al.Donor simvastatin treatment abolishes rat cardiac allograft ischemia/reperfusion injury and chronic rejection through microvascular protection[J].Circulation,2011, 124(10):1138-1150.

[13]Singh P,Deng A,Weir MR,et al.The balance of angiotensinⅡand nitric oxide in kidney diseases[J].Curr Opin Nephrol Hypertens, 2008,17(1):51-56.

[14]Rezkalla SH,Kloner RA.No-reflow phenomenon[J].Circulation, 2002,105(5):656-662.

[15]Gracia-Sancho J,Villarreal G,Zhang Y,et al.Flow cessation triggers endothelial dysfunction during organ cold storage conditions:strategies for pharmacologic intervention[J].Transplantation,2010,90(2): 142-149.

[16]Carney EF.Acute kidney injury:critical role of complement in End-MT[J].Nat Rev Nephrol,2014,10(4):183.

[17]Kizu A,Medici D,Kalluri R.Endothelial-mesenchymal transition as a novel mechanism for generating myofibroblasts during diabetic nephropathy[J].Am J Pathol,2009,175(4):1371-1373.

[18]Li J,Qu X,Bertram JF.Endothelial-myofibroblast transition contributes to the early development of diabetic renal interstitial fibrosis in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Am J Pathol,2009,175(4): 1380-1388.

[19]Mannon RB.Macrophages:contributors to allograft dysfunction,repair,or innocent bystanders[J].Curr Opin Organ Transplant,2012, 17(1):20-25.

[20]Li L,Huang L,Sung SS,et al.The chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 mediate monocyte/macrophage trafficking in kidney ischemia-reperfusion injury[J].Kidney Int,2008,74(12):1526-1537.

[21]Mosser DM,Edwards JP.Exploring the full spectrum of macrophage activation[J].Nat Rev Immunol,2008,8(12):958-969.

[22]Choe W,Kim S,Hwang TS,et al.Expression of inducible nitric oxide synthase in thyroid neoplasms:immunohistochemical and molecular analysis[J].Pathol Int,2003,53(7):434-439.

[23]Rauch I,Müller M,Decker T.The regulation of inflammation by interferons and their STATs[J].JAKSTAT,2013,2(1):e23820.

[24]Takeda K,Tanaka T,Shi W,et al.Essential role of Stat6 in IL-4 signalling[J].Nature,1996,380(6575):627-630.

[25]朱琳楠,侯玉柱.精氨酸酶及誘生性一氧化氮合酶在巨噬細胞中的分子表達調控[J].中國免疫學雜志,2010,26(8):748-753.

[26]Martinez FO,Helming L,Gordon S.Alternative activation of macrophages:an immunologic functional perspective[J].Annu Rev Immunol,2009,27:451-483.

[27]Popp RL,Velasquez O,Bland J,et al.Characterization of protein kinase C isoforms in primary cultured cerebellar granule cells[J]. Brain Res,2006,1083(1):70-84.

[28]Redling S,Pfaff IL,Leitges M,et al.Immunolocalization of protein kinase C isoenzymes alpha,betaⅠ,betaⅡ,delta,and epsilon in mouse kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2004,287(2): F289-298.

[29]Sekar MC,Yang M,Meezan E,et al.AngiotensinⅡand bradykinin stimulate phosphoinositide breakdown in intact rat kidney glomeruli but not in proximal tubules:glomerular response modulated by phorbol ester[J].Biochem Biophys Res Commun,1990,166(1): 373-379.

[30]Nowicki S,Kruse MS,Brismar H,et al.Dopamine-induced translocation of protein kinase C isoforms visualized in renal epithelial cells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2000,279(6):C1812-1818.

[31]Breyer MD,Jacobson HR,Hebert RL.Cellular mechanisms of prostaglandin E2 and vasopressin interactions in the collecting duct[J]. Kidney Int,1990,38(4):618-624.

[32]Dixon BS,Breckon R,Fortune J,et al.Bradykinin activates protein kinase C in cultured cortical collecting tubular cells[J].Am J Physiol, 1989,257(5 Pt 2):F808-817.

[33]馬慧萍,高榮敏,吳金華,等.大苞雪蓮乙醇提取物對模擬高原缺氧小鼠物質代謝的影響[J].解放軍藥學學報,2013,29(4):279-282.

[34]Lin YF,Lee HM,Leu SJ,et al.The essentiality of PKCalpha and PKCbetaI translocation for CD14+monocyte differentiation towards macrophages and dendritic cells,respectively[J].J Cell Biochem,2007, 102(2):429-441.

[35]Kelly DJ,Chanty A,Gow RM,et al.Protein kinase Cbeta inhibition attenuates osteopontin expression,macrophage recruitment,and tubulointerstitial injury in advanced experimental diabetic nephropathy [J].JAm Soc Nephrol,2005,16(6):1654-1660.

[36]Fuller TF,Kusch A,Chaykovska L,et al.Protein kinase C inhibition ameliorates posttransplantation preservation injury in rat renal transplants[J].Transplantation,2012,94(7):679-786.

[37]Liu Hui CH,Weimin S.Differential Expression of PKC isoforms and their tumoricidal activity in two macrophage cell lines involvement of nitric oxide-dependent mechanisms[J].The Chinese-German Journal of Clinical Oncology,2004,3(2):101-105.

[38]Picinich SC,Glod JW,Banerjee D.Protein kinase C zeta regulates interleukin-8-mediatedstromal-derivedfactor-1expressionand migration of human mesenchymal stromal cells[J].Exp Cell Res, 2010,316(4):593-602.

[39]畢良寬,林天歆,許可慰,等.IL-8通過激活PKC/ERK信號通路促進腎癌細胞上皮細胞-間質細胞轉化[J].生物化學與生物物理進展,2012,39(10):981-986.

[40]Wang J,Qin F,Deng A,et al.Different localization and expression of protein kinase C-beta in kidney cortex of diabetic nephropathy mice and its role in telmisartan treatment[J].Am J Transl Res,2015,7(6): 1116-25.

Influence of protein kinase C on macrophages in renal ischemia-reperfusion injury.

XIAO Ting,RONG Song. Department of Nephrology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003,Guizhou,CHINA

Ischemia-reperfusion injury(IRI)is inevitable for organ transplantation,and its pathophysiological mechanisms include apoptosis,generation of reactive oxygen species(ROS),innate immune system activation,microvascular dysfunction.The innate immune system is the first line of defense,also a critical component of organ transplantation.Macrophages are the critical early initiator of innate immunity in the kidney,which play a dual role in renal ischemia-reperfusion injury.Therefore,how to reduce macrophage infiltration is a hotspot of ischemia-reperfusion injury. Protein kinase C inhibitors can reduce macrophage infiltrate in the renal allografts through multiple pathways,but how it works is still unclear.

Renal ischemia-reperfusion injury(IRI);Innate immune system;Macrophage;Protein kinase C (PKC)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.034

R692

A

1003—6350（2017）08—1302—04

2016-08-17)

國家自然科學基金（編號：81160096）

容松。E-mail：songrong@hotmail.com