miR-122在胚胎干細胞/間充質干細胞誘導成肝細胞進程中的作用

丘賓明，曹殿青，胡喆

(廣東醫科大學附屬醫院麻醉科，廣東湛江524001)

miR-122在胚胎干細胞/間充質干細胞誘導成肝細胞進程中的作用

丘賓明，曹殿青，胡喆

(廣東醫科大學附屬醫院麻醉科，廣東湛江524001)

miR-122是一種肝臟特異性microRNA，在肝臟發育過程中扮演重要作用。本文主要介紹miR-122在胚胎干細胞誘導成肝細胞進程中的作用，miR-122并不促進胚胎干細胞向定型內胚層細胞方向分化，然而促進定型內胚層細胞/肝前體細胞向肝細胞分化和成熟，此作用與肝富集轉錄因子、上皮間質轉化等密切關聯。

胚胎干細胞；間充質干細胞；肝細胞樣細胞；分化；miR-122

肝細胞是肝臟的主要成分，在膽汁生成、物質代謝、凝血、人工肝的支持、基因治療等方面具有重要作用。然而獲取成熟的原代肝細胞非常困難，一旦離開人體內環境，則會迅速喪失分化再生能力。因此肝細胞的來源和誘導形成機制成為再生醫學研究亟待解決的問題。近年報道miR-122在肝臟的發生發展過程中扮演重要角色[1-2]，為解決肝細胞的誘導形成機制提供了新思路。本文就miR-122在胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESC)、間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)誘導成肝細胞/肝細胞樣細胞進程中的作用及分子機制進行論述。

1 miR-122的生物學特性

miR-122是一種肝臟特異性微小RNA(microRNA，長度為21～23 nt的非蛋白編碼RNA家族)。miR-122在小鼠胚胎發育12.5 d的胚肝細胞中開始表達，但其表達量低下，隨后表達量呈單邊加速上升，在出生之前達到平臺期，出生后仍以舒緩的速度不斷增多，直至成人肝臟中高達66 000拷貝，占肝臟總microRNA的72%[3]，此外miR-122在其他組織器官中表達極低[4]。這種表達模式在脊椎動物中高度保守[5]。

1.1 miR-122的生物合成、轉錄調控和轉錄后修飾miR-122來源于hcr基因轉錄本，該基因位于人18號染色體上(18q21.31)[6]。miR-122的合成過程：(1)首先以hcr為模板，在依賴DNA的RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ)的作用下轉錄形成pri-miR-122 (約4.5 kb)；(2)pri-miR-122在Drosha的裂解下形成pre-miR-122(66 nt)；(3)pre-miR-122在轉運蛋白Exportin 5的協助下轉運到細胞質中，然后在Dicer的裂解作用下形成成熟的miR-122[7]。成熟的miR-122有三種亞型：miR-122a(5'-UGGAGUGUGACAAUGGU GUUUGU-3'，23 nt)、miR-122b(5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGA-3'，23 nt)、miR-122ab(5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3'，22 nt)，還有一種miR-122ab降解產物(5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUU-3'，21 nt)，此四種形式處于動態平衡的狀態[8]。pri-miR-122表達量具有晝夜節律，主要是通過REV-ERBα抑制轉錄而實現，但miR-122表達量基本穩定[9]。hcr基因的啟動子區位于miR-122保守莖環序列上游大約5 kb處，包含若干核轉錄因子的結合序列(TATA-box、CCAAT-box等)，肝臟特異轉錄因子C/ EBPα、HNF1α、HNF3β、HNF4α、HNF6等[10]可以與其啟動子相互結合從而促進/抑制hcr基因轉錄，其具體機制尚未闡明。FOXO1是上游的轉錄因子，通過與miR-122上游核心啟動子區IRE位點結合，以實現調控hcr基因轉錄[11]，此外HNF4與FOXO1競爭性地結合到miR-122上游的核心啟動子區。microRNA轉錄后修飾通常是在3'末端添加1～3個核苷酸。GLD-2在miR-122的3'末端添加一個非模板核苷酸，此修飾對miR-122的穩定具有重要作用。當敲除GLD-2后，miR-122大幅度降解并伴隨miR-122靶基因表達升高[8]。

1.2 miR-122的靶基因和作用方式Gramantieri等利用miRbase數據庫對miR-122的所有潛在靶基因進行預測和分析，發現相當大比例的靶基因是肝臟代謝相關的重要酶類，并使用熒光素酶報告基因實驗予以驗證，證實miR-122調控多個糖類和脂類代謝的關鍵基因、細胞周期調節關鍵基因(Cycling G1等)[12]。此外STAT3[13]、陽離子氨基酰轉運蛋白-1(CAT-1)等都是miR-122的靶基因，其中STAT3是胚胎干細胞自我更新和分化的關鍵蛋白質，CAT-1與肝臟胚胎發育關系密切。

miR-122與靶基因的mRNA 3'非編碼區不完全互補結合而導致mRNA降解或翻譯抑制，從而在轉錄后水平調節基因的表達。與miR-122匹配的反義寡核苷酸轉染Huh-7細胞后，導致數百種miR-122的靶基因表達量增多；然而miR-122與丙型肝炎病毒RNA的5'-UTR相結合，反而促進其RNA表達[14]。

2 miR-122在胚胎干細胞向肝細胞誘導分化中的作用

胚胎發育第4.5天時，囊胚期的內細胞團分化為具有原始內胚層和原始外胚層的結構[15]，原始外胚層在胚胎發育第6.5天時通過原腸胚的過程分化形成外胚層、中胚層、內胚層，這一時期的內胚層稱為定型內胚層。肝母細胞開始從定型內胚層前端衍生并發展成肝憩室，然后在成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)等條件的作用下，肝母細胞迅速形成肝芽并增殖[16]，爾后在多種細胞信號誘導的共同作用下發育形成肝和胰臟[17]。ESC是從早期胚胎(原腸胚期之前)內細胞團中分離出來的一類細胞，它具有無限的自我更新、多向分化潛能的特性。無論在體外還是體內環境，ESC均能被誘導分化為機體絕大多數的體細胞，在一定條件下能夠向肝細胞或肝細胞樣細胞分化，其分化步驟大致可以分為三階段：內胚層細胞階段、成肝細胞階段、肝細胞樣細胞成熟階段。近年報道，miR-122在ESC誘導成肝細胞的各個階段中的作用不盡相同[18-19]，下面就miR-122在誘導肝細胞進程中的作用進行敘述。

2.1 miR-122在胚胎干細胞向定型內胚層細胞誘導分化中的作用體外培養的小鼠和人胚胎干細胞在去除飼養層以及關鍵細胞因子后可以自發形成擬胚體，擬胚體含有內胚層、中胚層、外胚層細胞。研究顯示激活素(Activin)/Nodal信號傳導通路在定型內胚層細胞形成的過程中不可或缺，在培養體系中添加Activin A后小鼠定型內胚層細胞占比可以提高到擬胚體細胞的80%，而Wnt蛋白能夠誘導胚胎干細胞極化，使其產生不對稱分裂，經過Wnt作用而形成的子代細胞能夠徹底地朝著截然不同的方向進行分化[20]，Roelandt等[21]往培養體系中添加Activin A、Wnt3a，不降低培養基的血清濃度的情況下，在誘導分化的第6日可檢測到絕大部分ESC分化成定型內胚層細胞(表達SOX17，SRY-related HMG-box gene 17)。此外，丁酸鈉能夠促進ESC分化為定型內胚層細胞，同時伴隨著miR-122和一些肝細胞特異基因表達升高。Tzru等[18]在誘導ESC分化為定型內胚層細胞進程中過表達miR-122，然后分析基因表達譜(GSE13460)，結果顯示表達升高的基因中包括HHEX(肝臟發育中具有重要作用)、CXCR4(定型內胚層標志基因)等關鍵基因，大約還有20%是人胚胎干細胞保持自我更新和全能性的關鍵基因(OCT4、NANOG、SOX-2等)。然而部分定型內胚層/肝細胞特異基因AFP、FOXA2、Albumin等表達并未升高。而在接下來的基因富集分析中發現表達降低的基因主要集中在整合素(integrin)信號傳導通路中，integrin能夠活化Grb2/Mek信號傳導通路，因此OCT4、SOX-2等全能性基因表達并未被抑制。文獻報道STAT3是miR-122的靶基因[13]，STAT3能夠促進OCT4表達，此實驗中ESC過表達miR-122后STAT3表達量下降，但是OCT4等基因表達反而升高，此結果可能是各方面因素共同作用所導致。表明過表達miR-122后引起的基因表達譜變化并不能使ESC向定型內胚層方向分化，而是能夠延遲ESC分化[18]。

2.2 miR-122在定型內胚層細胞向肝前體細胞誘導分化中的作用肝富集轉錄因子(liver-enriched transcription factors，LETFs)，包括HNF1α、HNF1β、FoxA2、HNF4α、HNF6、Liver receptor homolog 1等，在定型內胚層細胞向肝前體細胞分化過程中發揮關鍵性作用[22]。研究發現HNF6、HNF1、FoxA2、HNF4α、CCAAT/enhancer binding protein α通過與pri-miR-122的基因啟動子相互作用從而使miR-122表達量升高[10]，反之miR-122能夠促進LETFs表達，其分子機制尚不明確，其中miR-122與HNF6形成正反饋機制從而導致級聯反應[23]，而且HNF6能夠促進其他LETFs表達，研究表明HNF6促進HNF4α表達是通過與HNF4α啟動子互相結合而發揮調控作用[24]，從而促進定型內胚層細胞向肝前體細胞誘導分化。另外HNF6能夠活化TGF化進activin信號傳導通路，此信號傳導通路與ESC自我更新和肝臟發育密切相關，Laudadio等[23]在研究定型內胚層細胞向肝前體細胞誘導分化過程中干擾miR-122，爾后檢測基因表達譜，顯示26個肝特異基因表達下降，反面說明miR-122對肝特異性基因具有促進表達的作用，接下來在誘導斑馬魚肝前體細胞的過程中干擾miR-122，成熟的HNF4+/2F11+細胞明顯減少。

2.3 miR-122在肝前體細胞向成熟肝細胞誘導分化中的作用肝前體細胞誘導為肝細胞的方式主要有添加細胞因子(Activin A、GFG-4等)、表觀遺傳修飾物質(丁酸鈉等)、肝富集轉錄因子(FoxA1、HNF4α等)等，然而這些方法普遍存在程序復雜和誘導效率低下的問題。鄧小耿等[25]在改良誘導方法(添加丁酸鈉、地塞米松、肝生長因子)的前提下，在肝前體細胞中過表達miR-122，發現過表達miR-122后肝前體細胞在光鏡下呈現規則多邊形、核大居中、部分細胞可見雙核、胞漿豐富，肝特異性基因ALB、TTR、AAT、G-6-P、CK8、CYP7A1、CYF3A4的mRNA表達水平與對照組比較明顯升高，其誘導成熟的肝細胞樣細胞功能比對照組明顯增強。另一方面，當斑馬魚肝前體細胞敲除miR-122后不能成功分化為肝細胞樣細胞[26]，說明miR-122能夠促進肝前體細胞的分化和成熟。人肝前體細胞過表達miR-122后，檢測基因表達譜顯示59個基因探針表達升高，323個基因探針表達下降，其中升高的17個基因與肝臟分化、增生和肝功能密切相關[19]，而后實驗驗證過程中發現肝富集基因FoxA1、HNF4a、E-cadherin、Alb、TTR、AAT、G-6-P、CK8、Cyp7a1、Cyp3a4表達明顯升高，表明肝前體細胞誘導的過程中miR-122亦能夠調節特定肝富集轉錄因子的表達，從而促進肝前體細胞分化。此外，miR-122抑制Ihh、Loxl2表達，Ihh、Loxl2促進上皮間質轉化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)[27]，FoxA1、HNF4a在EMT和MET轉化的過程中具有重要作用[28]，可能miR-122能夠調節MET和EMT以致影響肝前體細胞的分化，其具體機制有待進一步研究。

3 miR-122在間充質干細胞向肝細胞誘導分化中的作用

間充質干細胞不僅能夠分化為骨、軟骨亦能夠分化為肝細胞[29]，在培養體系中加入成纖維細胞生長因子、肝生長因子、抑瘤素M、地塞米松等能夠誘導成肝細胞，而添加曲古抑菌素A能明顯提高效率。王雪[30]研究發現單獨使用microRNA(miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-Sp、miR-424、miR-148a)能夠將臍帶來源的間充質干細胞誘導成為具有功能的肝細胞樣細胞。另外，脂肪來源的間充質干細胞過表達miR-122后ALB、AFP、CK18、CK19、HNF4α的表達量明顯增多，并且在體外實驗中其誘導的肝細胞具備糖原儲集和尿素合成的能力[31]。然而miR-122在此誘導過程中的分子機制未見報道，深入探索其分子機制有利于優化肝細胞的誘導方案，以提高肝細胞樣細胞的質量、安全性和效率。

4 結語

肝細胞樣細胞是通過誘導胚胎干細胞、誘導多能干細胞、間充質干細胞、成纖維細胞而獲得。目前miR-122的研究集中在胚胎干細胞、間充質干細胞誘導成肝細胞樣細胞的進程中，而在誘導多能干細胞、成纖維細胞誘導成肝細胞樣細胞的進程中的作用有待探索。miR-122在胚胎干細胞向肝細胞樣細胞誘導的早期并未見促進作用，在誘導的中后期表現出顯著的促進作用，然而其作用機制仍不明確，有待深入研究。此外，miR-122在間充質干細胞誘導成肝細胞樣細胞過程具有促進作用，鑒于間充質干細胞具有來源廣、成瘤性低等獨特優勢，因此miR-122在解決肝細胞來源方面具有廣闊的應用前景。

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Role of miR-122 in the process of differentiation from embryonic stem cells/mesenchymal stem cells to hepatocyte-like cells.

QIU Bin-ming,CAO Dian-qing,HU Zhe.Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

miR-122,a completely conserved liver-specific microRNA in vertebrates,is essential for liver development.This article focuses on the role of miR-122 in the process of embryonic stem cells differentiation into hepatocyte-like cells.miR-122 cannot promote the differentiation of embryonic stem cells into definitive endoderm or hepatocyte-like cells,but can promote the differentiation and maturation of definitive endodermal cells/hepatic precursors into hepatocytes.The mechanism is closely related to the liver-enriched transcription factors and epithelial mesenchymal transition.

Embryonic stem cells;Mesenchymal stem cells;Hepatocyte-like cells;Differentiation;miR-122

R321

A

1003—6350（2017）16—2672—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.16.030

2016-12-15)

廣東醫學院博士啟動基金(編號：B2012044；B2012034)

胡喆。E-mail：biohuzhe@hot mail.om