大蒜素調節ApoE-/-小鼠心肌細胞凋亡及穩定易損斑塊的作用機制

謝敏，谷萬里

(1 青島大學醫學院，山東青島 266003；2 聊城市人民醫院)

·基礎研究·

大蒜素調節ApoE-/-小鼠心肌細胞凋亡及穩定易損斑塊的作用機制

謝敏1，谷萬里2

(1 青島大學醫學院，山東青島 266003；2 聊城市人民醫院)

目的 觀察大蒜素對ApoE-/-小鼠心肌細胞凋亡及Galectin-3、α-actin、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，探討大蒜素穩定易損斑塊的作用機制。方法 24只ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養8周，并隨機分為模型組、大蒜素低劑量組、大蒜素高劑量組。模型組給予0.5 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃、低劑量組給予0.15 mg/(kg·d)大蒜素灌胃、高劑量組給予0.30 mg/(kg·d)大蒜素灌胃連續8周。然后，小鼠眼球取血應用ELISA法測定血清糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平；取主動脈根部進行病理和免疫組化染色檢查壞死核心面積、心肌細胞凋亡陽性面積，取降主動脈至髂動脈分叉部分采用免疫印跡法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達。結果 三組小鼠血清GLU、TC、TG、LDL-C水平比較無統計學差異(P均>0.05)；三組小鼠主動脈根部斑塊內均存在明顯的壞死核心和脂質沉積，大蒜素低劑量組壞死核心面積及細胞凋亡陽性面積比值均小于模型組(P均<0.05)；與模型組比較，大蒜素低劑量組斑塊內巨噬細胞減少(P<0.05)，主動脈至髂動脈分叉部分抗凋亡蛋白Bcl-2明顯升高而促凋亡蛋白Bax顯著降低(P均<0.05)。結論 低劑量大蒜素可以通過抗凋亡抑制脂質沉積和壞死核心的形成，影響斑塊內容物和細胞成分達到穩定易損斑塊的作用。

動脈粥樣硬化；大蒜素；易損斑塊；細胞凋亡；小鼠

易損斑塊的概念首先由Muller等[1]于1992年提出，Naghavi等[2]將其完善為發展迅速更易形成血栓的肇事斑塊。易損斑塊是導致急性冠脈綜合征、心肌梗死、中風及多種心腦血管疾病的病理基礎。既往研究表明，大蒜素具有提高機體免疫力、調節血脂、抗血小板聚集、擴張血管及降血壓作用,是一種預防心血管疾病的天然藥物[3,4]，但其穩定斑塊的研究較少。2016年5～8月，本研究通過觀察不同濃度大蒜素對ApoE-/-小鼠易損斑塊的干預作用，從而評估大蒜素抑制巨噬細胞聚集、調節細胞凋亡及穩定動脈粥樣硬化斑塊的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡雄性ApoE-/-小鼠24只(品系背景C57BL/6，常州卡文斯實驗動物公司)，體質量20～22 g，飼以致動脈粥樣硬化膳食飼料 (江蘇美迪森生物醫藥有限公司)，飼養在SPF級動物室，室溫22～24 ℃，相對濕度50%，光照時間為7:00～19:00。大蒜素(藥物批號：國藥準字H42022592)由湖北金龍福公司提供；血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)ELISA試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司；免疫組化用Galectin-3、α-actin、Bcl-2、Bax抗體購自美國Santacruz公司；PVDF膜購自Millipore公司；兔抗小鼠α-actin抗體購自武漢博士德生物工程公司；其他二抗購于Abcam公司；ECL化學發光及BCA蛋白定量試劑盒購自南京碧云天公司。另有相差顯微鏡及照相系統(德國Carl Zeiss Jena公司)、圖像分析儀Image Pro Plus 6.0(美國Macro media公司)、M750-B型分光光度儀(日本導津公司)。

1.2 動物分組及處理 24只ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養8周，并隨機分為模型組、大蒜素低劑量組、大蒜素高劑量組各8只。模型組給予0.5 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃、低劑量組給予0.15 mg/(kg·d)大蒜素灌胃、高劑量組給予0.30 mg/(kg·d)大蒜素灌胃，連續8周。灌胃結束后1%戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，眼球取血應用ELISA法測定GLU、TC、TG、LDL-C。冰生理鹽水灌注去除血管內殘余血液，無菌條件下取出小鼠心臟保存于4%多聚甲醛中，降主動脈至髂動脈分叉處保存于液氮中。

1.3 組織病理學檢查 心臟常規脫水透明后行石蠟包埋，顯微鏡下觀察待管腔變圓后，于主動脈根部開始連續切片，切片厚度5 μm，每張切片保留2個組織面，每個標本留取30張切片。每間隔4張切片取1張進行TUNEL染色、Masson染色、天狼星紅染色以及Galectin-3(1∶200)、Bcl-2(1∶100)、Bax(1∶150)、α-actin(1∶50)免疫組化染色。取各個斑塊全視野拍照后利用IPP6.0軟件分析留取數據。Western blotting法檢測降主動脈至髂動脈分叉部分抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax的表達。

2 結果

2.1 三組血清糖脂水平變化 三組小鼠血清GLU、TC、TG、LDL-C水平比較無統計學差異(P均>0.05)。見圖1。

圖1 三組血清糖脂水平(mmol/L)

2.2 三組主動脈根部斑塊壞死核心面積、細胞凋亡陽性面積比值 Masson及TUNEL染色顯示，三組ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊內都存在明顯的壞死核心(棕色區域為陽性)，大蒜素灌胃處理后壞死核心面積及細胞凋亡陽性面積比值均有減小趨勢。見表1。

表1 三組壞死核心面積、細胞凋亡陽性面積比值比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.3 三組粥樣硬化斑塊內容物構成 與模型組比較，低劑量大蒜素灌胃處理后斑塊內巨噬細胞陽性區域(Galectin-3免疫組化染色)顯著減小(P<0.05)。與模型組比較，血管平滑肌細胞(α-actin免疫組化染色)、膠原成分(天狼星紅染色)表達無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 三組粥樣硬化斑塊內容物構成比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.4 兩組凋亡相關蛋白表達 與模型組比較，低劑量大蒜素處理后主動脈至髂動脈分叉部分抗凋亡蛋白Bcl-2明顯升高而促凋亡蛋白Bax顯著降低(P均<0.05)。見圖2。

圖2 兩組Bax和Bcl-2蛋白表達

3 討論

大蒜素作為中藥大蒜中的單體有效成分具有散寒通絡、活血化瘀的作用。唐代陳藏器在《本草拾遺》中記載大蒜“除風濕，破冷氣……宣通溫補，無以加之”。研究發現，大蒜素可以通過調控氣體信號分子和改善微循環，對寒凝血瘀型心肌缺血有較好治療和保護作用[5]。馬曉紅等[6]結扎動脈造成大鼠腦缺血微循環障礙,靜脈給予大蒜新素，發現該方法能較好地改善微循環異常，減少腦部缺血再灌注損傷。其他學者研究發現，大蒜素在抗人宮頸癌Hela細胞、肺癌細胞等方面均有誘導作用[7,8]。動脈粥樣硬化不穩定斑塊內的細胞凋亡是一種正調控的級聯反應過程[9]。巨噬細胞通過吞噬大量沉積在主動脈上的脂質形成泡沫細胞，而這些脂質對巨噬細胞本身具有毒性，而且易損斑塊內部微環境中的氧化應激、代謝產物及炎癥因子有促進細胞凋亡、壞死并加速臨近細胞凋亡作用，而大量壞死成分融和則形成富含脂質的血栓成分壞死核心[10]。斑塊內富含的膠原纖維成分覆蓋在壞死核心之上，可防止在血壓的作用下斑塊破裂壞死核心成分暴露，形成血栓導致腦梗死和心肌梗死等疾病。因此纖維帽的厚度和膠原的含量多少也決定了斑塊的穩定性[11]。平滑肌細胞成分是斑塊內分泌膠原的主要成分，有助于穩定易損斑塊。

細胞凋亡在促進不穩定斑塊的形成過程中起著重要作用[12]。Bcl-2家族是典型的抗凋亡蛋白，Bax則有顯著促斑塊內巨噬細胞凋亡的作用，Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡蛋白可以和Bax、Bad等促凋亡蛋白形成異二聚體防止凋亡的發生，Bcl-2和Bax蛋白之間的平衡決定了斑塊內凋亡的趨勢和走向[13]。我們發現，小劑量大蒜素具有顯著抑制斑塊內壞死核心和抗凋亡的作用，而且有助于增加斑塊內膠原面積、減少斑塊內巨噬細胞聚集。進一步研究發現斑塊內部抗凋亡蛋白Bcl-2明顯增加而促凋亡蛋白Bax顯著減少，因此大蒜素通過調控巨噬細胞凋亡、壞死從而穩定易損斑塊。本研究初步揭示了大蒜素穩定易損動脈粥樣硬化斑塊的作用機制，此為預防臨床斑塊破裂導致的急性事件提供了理論依據。

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山東省中醫藥科技發展計劃項目(2015485)。

谷萬里(E-mail:guwanli@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.009

R541.4

A

1002-266X(2017)01-0029-03

2016-09-19)