冠心病基因組學方法研究進展

李玫,曾志羽

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

·綜述·

冠心病基因組學方法研究進展

李玫,曾志羽

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

冠心病(CHD)是導致全球人群死亡和致殘的首要原因之一，其遺傳發(fā)病機制一直備受關注。CHD遺傳發(fā)病機制的基因組學研究常用方法分為連鎖分析、關聯(lián)分析、全基因組外顯子測序三種。連鎖分析能發(fā)現(xiàn)部分CHD的致病基因，但精確定位性差，與CHD相關研究較少。關聯(lián)分析，特別是全基因組關聯(lián)分析可彌補連鎖分析的不足，在CHD基因組學研究方面取得了突破性進展，但也存在研究樣本量大、遺傳度丟失等缺點。全基因組外顯子測序具有高通量、高精度、低成本的優(yōu)點，是研究CHD遺傳發(fā)病機制的一種較好方法。

冠狀動脈疾病；遺傳發(fā)病機制；連鎖分析；關聯(lián)分析；全基因組外顯子測序

目前大量研究證明，冠心病(CHD)是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引起的一種多基因復雜疾病[1]，其中遺傳因素作用占40%～60%[2]。因此從遺傳學角度來研究CHD有助于在分子水平探究其發(fā)病機制，使其做到早期診斷及個體化基因治療。長期以來，國內外學者大多應用連鎖分析及關聯(lián)分析兩種方法研究CHD相關的基因突變位點。近年來，隨著基因組學研究技術的快速發(fā)展，推動了一個新的研究方法——全基因組外顯子測序(WES)。目前該方法在單基因疾病和腫瘤的研究中已取得巨大的突破，但是對CHD的研究相對較少。現(xiàn)就這三種基因組學方法在CHD的研究進展進行綜述。

1 CHD基因連鎖分析及關聯(lián)分析

以往CHD基因組學研究方法大多是通過遺傳標記定位尋找與其相關的基因突變位點，采用限制性片段長度多態(tài)性或短串聯(lián)重復序列標記的連鎖分析以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記的關聯(lián)分析，利用PCR和第一代Sanger測序等技術對該染色體區(qū)域進行分析或定位克隆。

1.1 連鎖分析 連鎖分析主要以家系和同胞對為研究對象，通過遺傳標記對其進行基因分型，計算遺傳標記和性狀基因之間的重組率，估算兩者的連鎖程度和遺傳距離，將候選基因定位到染色體某一區(qū)間內的位置。連鎖分析包括參數(shù)連鎖分析和非參數(shù)連鎖分析兩種分析方法，參數(shù)連鎖分析主要以遺傳模式確定的大家系為研究對象；非參數(shù)連鎖分析對多基因疾病的研究有一定優(yōu)勢，主要以同胞對及數(shù)百個小的核心家系為研究對象。現(xiàn)連鎖分析已成功定位了部分CHD致病基因，如15q26染色體上的MEF2A基因[3]、12q13染色體上的LRP-6基因[4]和13q12-13染色體上的ALOX5AP基因[5]等，但因該方法的局限性，導致僅有少數(shù)基因位點在其他研究中得到了重復驗證。該方法的局限性有如下幾點：第一，該方法因對致病性高，數(shù)量少的遺傳變異比較敏感，所以對診斷明確、遺傳與表型一致的單基因疾病更有效，對復雜性疾病僅提供參考性意見；第二，研究對象主要是目前在世的幾代人，而基因重組在幾代人中發(fā)生的概率較小，所以得到的基因定位區(qū)域往往很大，這導致所得結果相對準確、假陽性小，但精細定位較困難；第三，該方法操作繁瑣且耗時長使得發(fā)現(xiàn)致病基因的效率降低。

1.2 關聯(lián)分析 關聯(lián)分析是以散發(fā)人群為研究對象，通過比較病例組和對照組等位基因頻率之間的差異尋找與疾病相關的基因位點，可用于多基因復雜疾病研究。該方法根據(jù)其掃描對象的不同，分為候選基因關聯(lián)分析和全基因組關聯(lián)分析(GWAS)。目前使用較多的是GWAS，它是通過一種高通量基因分型技術檢測成百上千的SNP，比較病例組和對照組SNP頻率之間的差異，篩選出與疾病性狀相關聯(lián)的基因位點。與候選基因相比，GWAS是在全基因組范圍內尋找與疾病相關的基因位點，所以不需事先做出假設和篩選出已知的“候選基因”；同時，它具有樣本量大、重復性好、可多中心研究且一次性可對上萬個SNP進行檢測等優(yōu)點，因此GWAS在人類遺傳疾病研究得到了廣泛應用。

到目前為止，GWAS在CHD遺傳學方面取得了豐富的成果，共發(fā)現(xiàn)了59個易感基因位點[6]。2007年，WTCCC通過GWAS首次在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)了與CHD顯著關聯(lián)的易感基因位點——9p21區(qū)域[7]。同年，GerMI協(xié)作組通過兩階段的GWAS研究發(fā)現(xiàn)了6個新的遺傳位點[8]。隨后3年，MIGen[9]、心電圖協(xié)會[10]和CHD遺傳協(xié)會[11]等協(xié)作組分別通過對大型數(shù)據(jù)整合，一共發(fā)現(xiàn)了23個新的基因位點。2012年，Lu等[12]在3.3萬余例CHD對照樣本中，成功地鑒定出4個全新的基因位點。2013年，歐洲人群進行了更大規(guī)模的數(shù)據(jù)整合，新發(fā)現(xiàn)了15個新的CHD遺傳位點[13]。2015年，Nikpay等[14]在18.5萬病例對照樣本中通過Meta分析，發(fā)現(xiàn)了10個新的基因位點。

盡管GWAS在CHD研究中取得了突破性的進展，但目前仍存在許多困難和限制。第一，因GWAS在第一階段研究獲得陽性結果后，還需進行多中心的獨立樣本驗證，所以需要大量的樣本研究才能獲得較準確的結果，這將耗費大量的人力和財力，普通的實驗室難以承擔；第二，種族差異性使結果難以在不同人群的研究中得到重復驗證，導致結果易產生假陽性和假陰性；第三，目前發(fā)現(xiàn)的CHD易感基因,只能解釋小部分的疾病遺傳度，未能解釋的遺傳變異被稱之為遺傳度丟失。隨著易感位點的最小等位基因頻率(MAF)逐漸下降，GWAS需要一定的樣本量才能達到足夠檢驗效能，所以GWAS鑒定的基因突變位點多為常見變異(MAF>0.05)，而對于檢測低頻變異(MAF<0.05)、罕見變異(MAF<0.01)和其他結構的變異較差。

2 CHD的WES

2.1 WES的特點 WES是由傳統(tǒng)外顯子捕獲技術和新一代高通量測序聯(lián)合形成的一種測序方法。由于WES只對外顯子進行測序，而外顯子包含蛋白質合成所需要的絕大部分信息，雖只占人類基因組約1%，但大約85%的疾病致病突變都位于該區(qū)域，因此與全基因組測序相比，WES具有成本低和效率高的優(yōu)勢。同時，WES也彌補了因GWAS研究得到的基因突變多位于基因間或內含子上，很少位于編碼區(qū)的缺陷。另外，WES還具有高通量、高精度等優(yōu)點，且對常見變異和罕見變異有高敏感性，能發(fā)現(xiàn)外顯子絕大部分與疾病相關的變異，尤其是那些基因芯片平臺中不涵蓋的稀有和低頻變異,因此WES既能用于單基因遺傳疾病的研究，也能用于多基因變異引起的常見疾病，以揭示這些疾病的遺傳致病機理。因該技術在疾病研究領域的廣泛應用和突出貢獻，在2010年被《Science》評為年度十大科技突破之一。

2.2 WES的基本流程和原理 WES基本流程包括外顯子序列的富集、高通量測序及數(shù)據(jù)的生物信息學分析，最后鑒定出相關基因突變位點。外顯子序列的富集包括捕獲和擴增兩個步驟。目前，常用的捕獲方法是雜交法，分為固相雜交或液相雜交，液相雜交因成本低、操作簡單，且具有良好的特異性和均一性被采用得更多，現(xiàn)常用的外顯子捕獲平臺有：Nimble Gen和Agilent Sure Select序列富集系統(tǒng)。富集的主要流程是：先碎片化DNA并在碎片末端連接上接頭，然后與外顯子芯片上的引物進行雜交，雜交后洗去未結合的背景和洗脫雜交的DNA片段，再對富集的DNA片段進行PCR擴增，最后得到目標區(qū)域的富集序列文庫，經檢驗合格后進行高通量測序。

DNA測序技術已被廣泛應用于生物學研究的各個領域。新一代高通量測序是一種邊合成邊測序技術，利用循環(huán)芯片測序法對布滿 DNA樣品的芯片進行PCR擴增以及熒光反應來讀取序列。目前，常用的測序技術平臺有：454基因組測序儀、Illumina測序儀、和SOLID測序。高通量測序的具體流程：利用特定平臺在基因組DNA碎片的兩側連上接頭,產生幾百萬個PCR單克隆陣列，所有單克隆同時、獨立地進行引物雜交和熒光標記的延伸反應,捕捉熒光標記信號，并經特殊軟件處理，獲取DNA序列數(shù)據(jù)。

經過高通量測序產生的龐大原始數(shù)據(jù)，需要進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析主要包括圖像信息數(shù)據(jù)分析以及生物信息學分析。圖像信息數(shù)據(jù)分析是通過特殊的軟件對原始數(shù)據(jù)進行處理，將其轉換為序列數(shù)據(jù)。然后利用生物信息學分析對序列數(shù)據(jù)進行過濾、評估以及檢驗其測序深度和覆蓋度，篩選出合格序列，再進行序列對比、檢測及注釋SNP、短小的插入或缺失。經數(shù)據(jù)分析得到的絕大部分結果為背景變異，不具有致病性，需要研究者采用各種方法綜合分析得到最后結果。

2.3 WES在CHD的應用 近年來，WES廣泛應用于單基因疾病和多基因疾病的研究，有研究表明，對于復雜疾病而言，散發(fā)病例的易感基因多來源于頻發(fā)的突變或新的突變，而家系的易感基因則大多為可遺傳突變[15]。因此WES對多基因復雜性疾病，可通過家系樣本進行探究，找出致病基因。CHD有明顯的家族聚集性，家族史是其發(fā)病的一個重要危險因素，且獨立于其他危險因素存在[16]。因此可通過家系研究來尋找其基因突變位點。

迄今，已有多個家系研究利用WES尋找到了CHD的基因突變位點。Erdmann等[17]通過對一個有32例CHD患者的大家系研究發(fā)現(xiàn)了GUCY1A3和CCT7兩個雜合突變，研究者首先對該家系進行了微衛(wèi)星連鎖分析，但未發(fā)現(xiàn)與心肌梗死疾病有關聯(lián)的染色體區(qū)域，然后在家族中篩選出3例有遠親關系的患者進行WES，在兩個功能性相關的基因中發(fā)現(xiàn)了這兩個雜合突變位點，后經過一系列的實驗對兩個突變位點進行功能性分析，最后得出兩個基因突變位點協(xié)同作用引起了心肌梗死。InanlooRahatloo等[18]通過對伊朗一個大家系的研究中發(fā)現(xiàn)了致病基因ST6GALNAC5，他們首先通過連鎖分析得到了三個與候選基因相關聯(lián)的染色體區(qū)域，然后通過對12例家系成員進行了外顯子測序，發(fā)現(xiàn)了ST6GALNAC5基因突變位點，接下來分別在伊朗160例患者和800例對照組及美國150例患者和800例對照組進行該位點測序驗證，最后得到突變位點為引起CHD的一個致病位點。Xu等[19]在一個四代皆有CHD患者的漢族家系中驗證了一個EFM2A突變，首先研究者通過對該家系的3例患者進行外顯子測序，發(fā)現(xiàn)了該突變位點，然后利用Sanger測序在7例患者的11號外顯子上發(fā)現(xiàn)了一個6bp堿基的缺失，接著在311例早發(fā)冠心病患者和323例未患病者進行了驗證，沒有發(fā)現(xiàn)該突變位點，但結合之前相關的研究，研究者認為該位點對冠心病的發(fā)生仍具有重要意義。Xie等[20]在一個早發(fā)心梗家系中發(fā)現(xiàn)了RECQL5基因突變位點，通過對家系中10例成員進行外顯子測序，其中4例是CHD患者，在13號染色體上發(fā)現(xiàn)了該突變位點，接著利用RT-PCR技術驗證由于12號外顯子的缺失導致了CHD的發(fā)生。

2.4 WES的局限性 目前，WES在研究人類遺傳疾病上取得了一定成功，但是該技術也有一定的局限性，主要存在以下問題。首先，WES缺少了對非編碼區(qū)變異和結構變異的研究，雖然大部分的致病基因位于外顯子，但仍有小部分位于非編碼區(qū)或由結構變異引起，所以有可能會導致致病基因的遺漏；其次，該技術因存在捕獲不均、捕獲偏差等現(xiàn)象，導致不能完全地捕獲變異的外顯子序列，現(xiàn)人類通過增加測序深度,獲得更多的序列信息進行統(tǒng)計分析,以盡可能的彌補這些偏差；最后，該技術的成本較之前降低了很多，但是在研究復雜疾病的罕見突變時,仍需要龐大的樣本量及高額的測序費用。

隨著基因組學技術的蓬勃發(fā)展，研究基因組的技術手段也日新月異。連鎖分析雖然發(fā)現(xiàn)了部分CHD致病基因，但因其精確定位性差等局限性，導致與CHD相關研究并不多；關聯(lián)分析的出現(xiàn)彌補了連鎖分析的不足，特別是GWAS，因其各方面的優(yōu)勢，在CHD基因組學方面取得了突破性進展，但也因其樣本量大、遺傳度丟失等缺點，使得CHD的研究處于“瓶頸期”；WES的出現(xiàn)提供了一個轉機，WES具有高通量、高精度、低成本的優(yōu)點，是一種很好的研究CHD的方法。目前CHD通過GWAS研究在散發(fā)人群中已取得了突破性進展，但關于家系的研究仍舊較少，而WES的研究對象既可以是散發(fā)人群也可以是家系，因此可以以家系作為研究對象尋找CHD的基因突變位點，現(xiàn)已有研究通過此方法發(fā)現(xiàn)了與CHD相關的基因突變位點，證明此方法是可行的。經上述三種方法研究，CHD在基因組學方面取得了一定的成就，但它們都有各自局限性，因此在今后的研究中，需要繼續(xù)完善各個基因組研究方法，為了解CHD發(fā)病機制和實現(xiàn)個體化治療提供新的見解。

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