膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1基因突變與新生兒黃疸易感性的關系

陳虹，鐘丹妮，高宗燕，吳曉靜，韋露明

(廣西醫科大學第一附屬醫院,南寧530021)

膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1基因突變與新生兒黃疸易感性的關系

陳虹，鐘丹妮，高宗燕，吳曉靜，韋露明

(廣西醫科大學第一附屬醫院,南寧530021)

目的 探討膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1基因(UGT1A1)第1外顯子A1及啟動子區TATA盒基因突變與廣西新生兒黃疸的關系。方法 152例廣西籍新生兒分為高膽紅素血癥組(病例組)102例及健康對照組50例，采用PCR和DNA直接測序法檢測兩組UGT1A1第1外顯子及啟動子區TATA盒基因型，比較兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率差異，觀察病例組UGT1A1基因突變類型及其不同基因型患兒出生后72 h后血清總膽紅素水平。結果 兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率比較差異有統計學意義(P均<0.01)。病例組檢出G71R錯義突變40例，啟動子A(TA)7突變2例，715C→T雜合無義突變1例。病例組G71R純合子患兒血清總膽紅素水平高于野生型及雜合子患兒(P均<0.05)。結論 UGT1A1基因 G71R突變是廣西新生兒黃疸主要突變類型，該突變與新生兒高膽紅素血癥有密切關系；新發現的715C→T無義突變可能是新生兒膽紅素腦病發生的重要原因之一。

高膽紅素血癥；新生兒；膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1；基因

新生兒黃疸或高膽紅素血癥是新生兒期的常見表現，是由于新生兒血中膽紅素升高引起的皮膚黏膜黃染現象，及時治療后大部分嬰兒恢復正常；如黃疸重癥且治療不及時，過多的膽紅素可通過血腦屏障引發膽紅素腦病，損害新生兒中樞神經系統，導致新生兒聽力、運動、智力受損，甚至死亡。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1(UGT1A1)是體內催化膽紅素進行解毒作用的關鍵酶[1]。目前全世界已確定UGT1A1基因存在130余種突變類型[2]，其中大多數基因突變可導致酶活性降低或缺失，影響體內膽紅素的結合反應，使膽紅素積聚而引起黃疸,且其基因突變類型存在人種和地域差異。廣西是新生兒黃疸的高發區，目前尚有部分患兒的黃疸病因及機理不明。本研究探討UGT1A1第1外顯子及啟動子區TATA盒突變與廣西新生兒黃疸的關系，以便為廣西新生兒黃疸的病因診斷及治療提供更多遺傳學依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年12月～2015年12月在本院確診為高膽紅素血癥的廣西籍足月新生兒102例(病例組)。男54例、女48例，胎齡(274.2±9.8)d，出生體質量(3 249.6±304.3)g，日齡3～7 d。新生兒高膽紅素血癥的診斷標準為：血清總膽紅素升高且以間接膽紅素升高為主，時齡血清總膽紅素值達到或超過2014年新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識[3]的新生兒小時膽紅素列線圖第95百分位；同時排除影響和引起新生兒黃疸的因素如新生兒溶血癥、G6PD缺乏癥、敗血癥、窒息、低血糖、酸中毒、高熱、低體溫等。102例患兒中，有膽紅素腦病2例，90%為母乳喂養，經光療、藥物治療黃疸完全消退。另取同時期本院廣西籍足月健康新生兒50例(對照組)，男26例、女24例，胎齡(275.6±8.2)d，出生時體質量(3 220.5±417.3)g；其性別構成、胎齡、出生體質量等與病例組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。對照組早期部分出現黃疸，但膽紅素水平未達到新生兒高膽紅素血癥的診斷標準；新生兒全部母乳喂養，黃疸無需干預，自行完全消退。

1.2 UGT1A1基因檢測 采集新生兒臍血或外周血(ACD抗凝)2 mL，利用DNA抽提試劑盒(TIANGEN公司產品)，依照說明書行外周血白細胞DNA提取，放置-20 ℃保存備用。根據UGT1A1基因第1外顯子序列和側翼結構并參考文獻[4]設計引物。序列為：F引物5′-AAGTGAACTCCCTGCTACCTT-3′，R引物5′-GCTTGCTCAGCATATATCTGGG -3′。引物序列由上海生工生物工程技術服務公司合成。引物擴增包含第1外顯子A1及TATA盒的1 106 bp片段。PCR反應體系:總體積 50 μL,10×PCR緩沖液(15 mmol MgCl2) 5 μL,4×dNTP(10 mmol)1.0 μL,測序引物F、R各1.0 μL，模板DNA 1.0 μg,Taq DNA聚合酶2.5 μL，去離子水補充至50 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性8 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環35次；72 ℃延伸8 min。取PCR產物加入loading buffer混勻，采用含Ⅰ型核酸染料的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將鑒定正確的PCR產物送上海生物工程公司進行DNA直接測序。

1.3 新生兒血清總膽紅素水平檢測 出生后72 h取新生兒靜脈血2 mL，EDTA抗凝,采用全自動生化分析儀測定血清總膽紅素值。

2 結果

2.1 UGT1A1基因突變類型 ①G71R錯義突變40例： UGT1A1基因第1外顯子區第211位有G→A點突變(G211A)，第71位密碼子GGA變成AGA，相應編碼的甘氨酸變成精氨酸(Gly71Arg，G71R)。測序結果見圖1。②啟動子A(TA)7突變2例：TATA盒野生型為A(TA)6TAA，TA數目改變為TATA盒 A(TA)7TAA。測序結果見圖2。③715C→T雜合無義突變1例：UGT1A1基因第1外顯子區第715位C→T置換，導致終止密碼子TAG取代谷氨酰胺密碼子CAG，提前出現的終止密碼子使多肽鏈合成提前終止致UGT1A1活性完全喪失。該患兒因是雜合子，只表現UGT1A1活性減低。測序結果見圖3。全部152例樣本在UGT1A1基因第1外顯子均未檢出其他突變類型，如F83L、P229Q突變等，即全部是野生型。

圖1 G71R測序圖

圖2 TATA盒測序圖

圖3 715位堿基測序圖

2.2 兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率 兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率比較差異有統計學意義(χ2分別為13.495、16.801,P均<0.01)。見表1。

2.3 病例組G71R不同基因型新生兒血清膽紅素水平 病例組102例患兒根據基因型不同分為G71R突變型純合子(A/A)10例、雜合子(A/G)26例、野生型(G/G)66例，出生后72 h各型血清膽紅素水平分別為(23.7±4.8)、(18.2±2.9)、(17.3±2.7)mg/dL。G71R純合子與野生型和雜合子比較，血清膽紅素水平差異有統計學意義(P均<0.05)；G71R雜合子與野生型比較，血清膽紅素水平差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率比較

3 討論

UGT1A1酶是動物體內重要的代謝酶，大量內源性和外源性化合物在其催化下與尿苷二磷酸葡萄糖醛酸進行葡萄糖醛酸結合反應,形成葡萄糖醛酸結合物,水溶性增加，易于隨膽汁和尿液排出。因此，葡萄糖醛酸結合反應是體內產物和體外異物在機體內重要的解毒途徑。UGT1基因位于人類2號染色體長臂(2q37)，由5′端的第1外顯子和3′端的第2～5共同外顯子組成。每個第1外顯子編碼獨特的氨基末端區，這是與底物的結合部位，決定同工酶的底物特異性；不同的同工酶與葡萄糖醛酸結合的共同位點由第2～5共同外顯子編碼。UGT1A1酶是第1外顯子A1和第2～5共同外顯子編碼組成的產物，能特異性催化膽紅素葡萄糖醛酸結合反應。UGT1A1基因包括起調節表達作用的啟動子區和編碼區，前者含TATA盒，為非編碼區。目前已證實UGT1A1的多態性是引起黃疸的重要遺傳因素，在基因非編碼區啟動子突變使表達減少或基因編碼區發生等位突變都會使UGT1A1酶活性降低，引起不同程度的高膽紅素血癥。

迄今為止，世界范圍內已確定的UGT1A1基因突變類型有130余種，在第1外顯子及啟動子區就存在50余種。UGT1A1基因突變類型存在人種和地域差異，在歐美、非洲地區較多見的是啟動子TATA盒的插入或缺失突變[5，6]，亞洲地區僅有少量該突變類型的報道。本研究檢出G71R突變較多，其等位基因頻率在病例組和對照組分別為22.55%、4.0%，與我國臺灣地區Huang等[7]的研究結果相近，但低于日本人群[8]。這與報道的亞洲地區編碼區突變較多見且G71R為主要突變類型相符[9]。該突變為UGT1A1基因第一外顯子的211位堿基由G突變為A，使71號密碼子由編碼甘氨酸的GGA變為編碼精氨酸的AGA。病例組G71R等位基因頻率明顯高于對照組，提示G71R突變與廣西新生兒病理性黃疸的發病存在相關性。同時本研究顯示G71R突變型純合子高膽紅素血癥患兒出生72 h后總膽紅素水平明顯高于野生型，提示G71R突變加重廣西新生兒黃疸的嚴重程度,與本課題組之前的研究一致[10]。因此認為G71R突變是廣西新生兒高膽紅素血癥發生、發展的高危因素，是新生兒病理性黃疸的病因之一。本研究人群中僅檢出2例黃疸患兒發生啟動子區(TA)7突變，未檢出第1外顯子區F83L、P229Q等突變。說明(TA)7突變不是本研究人群黃疸的主要致病因素，與國外報道的(TA)7突變并非亞洲主要突變類型一致[4]。

本研究發生1例膽紅素腦病患兒其UGT1A1基因發生715C→T雜合突變，該715C→T無義突變使編碼谷氨酸的密碼子變為終止密碼子，提前出現的終止密碼子導致UGT1A1酶活性顯著降低繼而發生重癥黃疸即膽紅素腦病。對該患兒家族成員進行了追蹤研究，顯示該患兒的父母均存在715C→T雜合突變，該患兒生后4 d時出現膽紅素腦病癥狀，經換血、光療、藥物等積極治療，患兒黃疸完全消退好轉出院。而其姐姐在幾年前因高膽紅素血癥入住本病區，于1歲6個月時因反復重度高膽紅素血癥治療無效夭折。當時收集其血標本提取DNA行UGT1A1基因多態性檢測，應用突變特異性擴增系統法僅檢測出已發現的G71R常見突變點，所以未能及時發現該新突變。現將其姐姐的DNA標本按本研究方法進行第1外顯子A1及啟動子區TATA盒基因突變檢測，發現存在715C→T純合無義突變，該突變使編碼谷氨酰胺的密碼子變為終止密碼子(Q239X)，提前出現的終止密碼子可導致UGT1A1酶活性完全喪失，診斷為Crigler-Najjar Syndrome Type Ⅰ[11]。因此715C→T突變可能是新生兒發生膽紅素腦病的重要原因之一，是新生兒黃疸的致殘致死突變類型。

近年來，有研究者對11例高未結合膽紅素血癥——Crigler-Najjar Syndrome Type Ⅱ患者的UGT1A1基因行全基因突變檢測，發現Y486D突變是其主要致病因素[12]，與日本[13]和韓國[14]的研究結果一致。Y486D突變是UGT1A1基因第5外顯子的1 456位堿基由T突變為G，使486號密碼子由酪氨酸變為天冬氨酸 (c.1456T>G:p.Y486D)。本課題組前期對218例高膽紅素血癥及190例健康新生兒行UGT1A1基因全基因突變檢測，未檢出該突變類型[15]。提示Y486D突變可能與廣西新生兒黃疸的發病無直接相關性，因此本研究中未涉及到UGT1A1基因第5外顯子的突變檢測。至于廣西新生兒黃疸是否存在Y486D突變，有待擴大樣本進一步研究。

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Relationship between bilirubin uridine diphosphate-glucuronosyl transferase 1A1 gene mutation and susceptibility to neonatal jaundice

CHENHong,ZHONGDanni,GAOZongyan,WUXiaojing,WEILuming

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the relationship between newborn jaundice of Guangxi population and the gene mutation in exon 1 and TATA box of bilirubin uridine diphosphate-glucuronosyl transferase (UGT1A1).Methods Totally 102 cases with newborn hyperbilirubinemia (case group) and 50 neonates without newborn jaundice (control group) were included.TATA box and exon 1 genotypes of UGT1A1 in the two groups were detected by PCR and direct sequencing.UGT1A1 G71R genotype distribution and the differences in allele frequencies were compared between these two groups.The types of UGT1A1 mutation in the case group and the total serum bilirubin (TSB) levels in children patients at 72 hours after birth with different genotypes were observed.Results Significant difference was found in the UGT1A1 G71R genotype distribution and allele frequencies between these two groups (allP<0.01).There were 40 cases with G71R missense mutation,2 cases with (TA)7 insertion mutation,and 1 case with 715C→T heterozygous nonsense mutation in the case group.In the case group,the TSB level of G71R homozygous children patients was higher than that of the wild type and heterozygous children (allP<0.05).Conclusions The G71R mutation of UGT1A1 gene is the main mutation type and closely related with newborn hyperbilirubinemia in Guangxi region.The new-found 715C→T nonsense mutation may be one of the important causes of neonatal bilirubin encephalopathy.

hyperbilirubinemia; neonatal; bilirubin uridine diphosphate-glucuronosyltransferase1A1; gene

國家自然科學基金資助項目(81060055)。

陳虹(1990-),女，碩士，研究方向為新生兒黃疸。E-mail:1160087221@qq.com

鐘丹妮(1962-)，女，教授，研究方向為新生兒疾病。主持國家自然科學基金2項，廣西自然科學基金項目多項；其“廣西新生兒黃疸臨床特點與葡萄糖醛酸轉移酶”的研究獲廣西科技進步三等獎。E-mail:danny5911@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.007

R575

A

1002-266X(2017)01-0022-04

2016-08-05)