細(xì)胞色素上皮源性因子對(duì)巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白表達(dá)的影響

路建軍，張勇濤，倪梅，呂慧霞

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，濟(jì)南250012；2齊河縣人民醫(yī)院；3青島市中心醫(yī)院)

細(xì)胞色素上皮源性因子對(duì)巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白表達(dá)的影響

路建軍1,2，張勇濤3，倪梅1，呂慧霞1

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，濟(jì)南250012；2齊河縣人民醫(yī)院；3青島市中心醫(yī)院)

目的 探討細(xì)胞色素上皮源性因子(PEDF)對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞表面CD36蛋白表達(dá)的影響。方法 選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組、PEDF組各10只，PEDF組尾靜脈注射PEDF，對(duì)照組尾靜脈注射同等量的生理鹽水；高脂喂養(yǎng)16周處死小鼠，采用免疫組化染色法檢測(cè)兩組主動(dòng)脈根部組織巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白表達(dá)。將RAW264.7細(xì)胞以高糖DMEM培養(yǎng)24 h后分為ox-LDL組、ox-LDL+陰性病毒轉(zhuǎn)染(G)組、ox-LDL+PEDF組、Con組。待細(xì)胞貼壁約8 h后，ox-LDL組、ox-LDL+ G組、ox-LDL+PEDF組均給予ox-LDL 80 μg/mL，Con組不給予ox-LDL；另將腺病毒包繞的PEDF以MIC值為30轉(zhuǎn)染進(jìn)ox-LDL+PEDF組細(xì)胞；應(yīng)用免疫印跡法測(cè)定四組RAW264.7細(xì)胞CD36表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，PEDF組主動(dòng)脈根部AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表面CD36 蛋白表達(dá)降低(14.00±1.155 vs 29.00±0.577，P<0.05)。ox-LDL組、ox-LDL+G組、ox-LDL+PEDF組、Con組RAW264.7細(xì)胞CD36蛋白表達(dá)分別為0.754±0.055、0.831±0.072、0.547±0.002、0.339±0.033；與Con組比較，ox-LDL組、ox-LDL+G組CD36蛋白表達(dá)水平升高(P均<0.05)；與ox-LDL組、ox-LDL+G組比較，ox-LDL+PEDF組CD36蛋白表達(dá)水平降低(P均<0.05)。結(jié)論 PEDF能有效下調(diào)巨噬細(xì)胞表面CD36的表達(dá)，可能是未來(lái)AS治療中的潛在靶點(diǎn)。

動(dòng)脈粥樣硬化；細(xì)胞色素上皮源性因子；CD36 ；小鼠

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)具有變質(zhì)、滲出和增生等炎癥性疾病的基本病理特征，而炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)是其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。脂蛋白在血管內(nèi)膜的過(guò)度積累可激活內(nèi)皮細(xì)胞，生成趨化因子，促使單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜，并分化為成熟的巨噬細(xì)胞。在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下，巨噬細(xì)胞不斷攝取氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)等被修飾的脂蛋白。當(dāng)巨噬細(xì)胞內(nèi)積聚的脂質(zhì)超過(guò)其自身代謝能力時(shí)，則轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，逐漸形成AS斑塊[2]。細(xì)胞色素上皮源性因子(PEDF)屬于絲氨酸蛋白酶超家族成員，具有高度保守的序列和獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，在心血管系統(tǒng)中具有抗炎、抗血栓、抗凋亡及抑制血管新生等作用[3]。既往研究證實(shí)，清道夫受體(SRs)CD36是調(diào)控巨噬細(xì)胞泡沫化，促進(jìn)AS形成的關(guān)鍵因子[4]。然而，PEDF是否可以影響CD36的表達(dá)及功能，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)的過(guò)程，發(fā)揮抗AS作用，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。2014年12月～2015年12月，我們通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)對(duì)AS形成過(guò)程中PEDF與CD36之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性ApoE-/-小鼠20只，均購(gòu)自于北京維通利華公司；兔抗鼠CD36多克隆抗體購(gòu)自于美國(guó)Santa Cruz公司，SP-9001免疫組化試劑盒、DAB顯色液、羅丹明標(biāo)記山羊抗鼠IgG均購(gòu)自于北京中杉生物技術(shù)有限公司，PEDF購(gòu)自于Abcam公司,RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自于美國(guó)ATCC。

1.2 小鼠分組及處理 ApoE-/-小鼠20只飼喂1周，隨機(jī)分為對(duì)照組、PEDF組各10只，高脂喂養(yǎng)16周。PEDF組尾靜脈注射PEDF，劑量為1×108TU/只；對(duì)照組尾靜脈注射同等量的生理鹽水。兩組ApoE-/-小鼠處死后分別取主動(dòng)脈根部組織，迅速置入4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.3 AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化染色法。取小鼠主動(dòng)脈根部組織切片，按照SP-9001免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。一抗為兔抗鼠CD36多克隆抗體，1∶100倍稀釋；陰性對(duì)照一抗為PBS。新鮮配置的DAB溶液顯色3～5 min，自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。在400倍視野下，每例標(biāo)本選5張切片，每張切片選主動(dòng)脈組織分布及染色均勻的4個(gè)視野，采用Image pro-Plus 6.0圖文分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)棕色反應(yīng)顆粒判定為陽(yáng)性，以陽(yáng)性表達(dá)面積與總面積的比值作為相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.4 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)、分組及PEDF轉(zhuǎn)染 將RAW264.7細(xì)胞種植于6孔板，以高糖DMEM(10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)貼壁培養(yǎng)24 h，然后分4組，即ox-LDL組、ox-LDL+陰性病毒轉(zhuǎn)染(G)組、ox-LDL+PEDF組、Con組。待細(xì)胞貼壁約8 h后，ox-LDL組、ox-LDL+ G組、ox-LDL+PEDF組均給予ox-LDL 80 μg/mL，Con組不給予ox-LDL；另將腺病毒包繞的PEDF以MIC值為30轉(zhuǎn)染進(jìn)ox-LDL+PEDF組細(xì)胞，24 h后觀察轉(zhuǎn)染的情況，使轉(zhuǎn)染效率達(dá)100%。

1.5 RAW264.7細(xì)胞CD36蛋白表達(dá) 采用免疫印跡法檢測(cè)。收集各組RAW264.7細(xì)胞，提取總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，-40 ℃凍存。取蛋白提取液以10% SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗CD36(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育2 h，ECL發(fā)光液孵育5 min后置于圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描。目的蛋白和內(nèi)參條帶的灰度值以Image pro-Plus 6.0圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白表達(dá) PEDF組主動(dòng)脈根部AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表面CD36 蛋白為14.00±1.155，對(duì)照組為29.00±0.577;與對(duì)照組比較，PEDF組主動(dòng)脈根部AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表面CD36 蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 四組RAW264.7細(xì)胞CD36蛋白表達(dá) ox-LDL組、ox-LDL+G組、ox-LDL+PEDF組、Con組RAW264.7細(xì)胞CD36蛋白表達(dá)分別為0.754±0.055、0.831±0.072、0.547±0.002、0.339±0.033。與Con組比較，ox-LDL組、ox-LDL+G組CD36蛋白表達(dá)水平升高(P均<0.05)。與ox-LDL組、ox-LDL+G組比較，ox-LDL+PEDF組CD36蛋白表達(dá)水平降低(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：A為對(duì)照組；B為PEDF組；與對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖1 兩組主動(dòng)脈根部AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白表達(dá)

注：與Con組比較，*P<0.05；與ox-LDL、ox-LDL+G組比較，#P<0.05。

圖2 四組RAW264.7細(xì)胞CD36蛋白表達(dá)

3 討論

CD36屬于B類SRs，在20世紀(jì)80年代，最初作為血栓黏合素的受體在血小板的表面被發(fā)現(xiàn)，隨后研究證實(shí)，其廣泛存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞以及AS病變中[5]。目前認(rèn)為，AS斑塊的大小、穩(wěn)定性均與巨噬細(xì)胞不斷吞噬ox-LDL，形成泡沫細(xì)胞有關(guān)，而CD36又是巨噬細(xì)胞發(fā)揮這一功能的關(guān)鍵因子，巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL量的60%～70%均依賴于CD36的正常功能[4,6,7]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)單純給予小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞ox-LDL刺激，其CD36蛋白表達(dá)水平較Con組顯著增高，說(shuō)明了巨噬細(xì)胞在吞噬ox-LDL的過(guò)程中，其CD36蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。隨后，我們又將PEDF轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果顯示，ox-LDL組的CD36蛋白表達(dá)水平與ox-LDL+G組相仿，說(shuō)明陰性病毒對(duì)巨噬細(xì)胞的CD36表達(dá)影響較小。但是，PEDF組CD36蛋白表達(dá)水平較ox-LDL組、ox-LDL+G組顯著降低。由于小鼠的AS斑塊與人類極其相似，且小鼠基因序列已知，可以對(duì)其進(jìn)行基因敲除或基因敲入，故已成為目前應(yīng)用最為廣泛的AS動(dòng)物模型[8]。因此，在體內(nèi)研究中，我們利用高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立AS動(dòng)物模型，并給予PEDF干預(yù)。結(jié)果顯示，PEDF干預(yù)能顯著抑制主動(dòng)脈根部AS斑塊內(nèi)CD36的表達(dá)。AS是血管壁的慢性炎癥，是對(duì)血管壁損傷的一種反應(yīng)和修復(fù)過(guò)程。而單核/巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞是這一過(guò)程的主要炎癥細(xì)胞[9]。既往研究也證實(shí)人冠狀A(yù)S斑塊內(nèi)含大量巨噬細(xì)胞和激活的T淋巴細(xì)胞，尤其是在不穩(wěn)定心絞痛斑塊內(nèi)[10]。并且，CD36主要在巨噬細(xì)胞表面表達(dá)。因此，我們認(rèn)為PEDF對(duì)AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的CD36表達(dá)具有顯著下調(diào)作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)，PEDF可以直接作用于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其發(fā)生遷移和分化[11]。另外，PEDF促腫瘤細(xì)胞死亡的作用與其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞膜TRAIL的表達(dá)有關(guān)[12]。這些研究均提示PEDF與巨噬細(xì)胞間存在密切的聯(lián)系，PEDF是調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的上游靶點(diǎn)。PEDF是一種多功能蛋白，在體內(nèi)具有抗炎、抗血栓形成和血管保護(hù)作用[13]。研究報(bào)道，PEDF不僅可以抑制大鼠球囊拉傷術(shù)后的動(dòng)脈新生內(nèi)膜增生，還可以抑制閉塞性血栓形成[14,15]。另外，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的PEDF表達(dá)下調(diào)可以改善ox-LDL引起的血管內(nèi)皮損傷[16]。這些研究均證實(shí)PEDF具有顯著的抗AS作用。

綜上所述，PEDF具有抑制AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞SRs CD36表達(dá)的作用。但是，PEDF是否對(duì)AS患者具有保護(hù)作用，仍需進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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Effect of pigment epithelium-derived factor on expression of CD36 protein on surface of macrophages

LUJianjun1,ZHANGYongtao,NIMei,LYUHuixia

(1QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China)

Objective To determinate the effect of pigment epithelium-derived factor (PEDF) on the expression of CD36 protein on the surface of macrophages in mouse atherosclerotic plaque and RAW264.7 cells.Methods In vivo,20 male ApoE-/-8-week-old mice were randomly divided into two groups:the control group and PEDF group.Ten mice in PEDF group were intravenously injected with PEDF to achieve high-level PEDF expression,and ten mice in the control group were given same amount of saline solution.The mice were put to death after 16-week high-fat feeding.The aortic root tissues were removed and immunohistochemistry was applied to evaluate the expression of CD36 protein on the surface of macrophages.In vitro,RAW264.7 cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose.After 24 hours,the RAW264.7 cells were divided into four groups:ox-LDL group,ox-LDL+ negative vector (G) group,ox-LDL + PEDF group,and Con group.In addition to the Con group,the other three groups were given 80 μg/mL ox-LDL.A adenovirus vector containing a mouse PEDF expression sequence was constructed and transduced into ox-LDL + PEDF group with MIC value of 30.CD36 expression in the four groups was assessed by Western blotting.Results The expression of CD36 protein on the surface of macrophages in aortic root plaque of the PEDF group was 14.00±1.155,which was lower as compared with that of the control group 29.00±0.577,P<0.05.In vitro,the expression of CD36 protein in the ox-LDL group,ox-LDL+G group,ox-LDL + PEDF group,and Con group was 0.754±0.055,0.831±0.072,0.547±0.002,and 0.339±0.033,respectively.Compared with Con group,the expression of CD36 protein in the ox-LDL group and ox-LDL+G group was increased (allP<0.05).Compared with ox-LDL group and ox-LDL+G group,the expression of CD36 protein in the ox-LDL + PEDF group was decreased (allP<0.05).Conclusion PEDF can effectively down-regulate CD36 expression on the surface of macrophages,which suggests that PEDF may serve as a potential target in the treatment of atherosclerosis.

atherosclerosis; pigment epithelium-derived factor; CD36; mice

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81270403)；“香江學(xué)者”項(xiàng)目計(jì)劃(201104629)；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2014M551914)。

路建軍(1982-)，男，在讀研究生，主要研究方向?yàn)楣跔顒?dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制及臨床診治。E-mail:sgly120@163.com

倪梅(1972-)，女，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)楣谛牟〉陌l(fā)病機(jī)制及臨床診治。E-mail:nimei999@163.com

呂慧霞(1975-)，女，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制及其干預(yù)。E-mail:lvhuixia2004@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.002

R541.4

A

1002-266X(2017)01-0004-04

2016-07-28)