G蛋白偶聯膽汁酸受體1激活對高糖誘導小鼠心肌細胞肥大的影響

馮健，吳丹，陳旭昕，劉應才，李家富

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000；2中國人民解放軍海軍總醫院)

·論著·

G蛋白偶聯膽汁酸受體1激活對高糖誘導小鼠心肌細胞肥大的影響

馮健1，吳丹1，陳旭昕2，劉應才1，李家富1

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000；2中國人民解放軍海軍總醫院)

目的 探討G蛋白偶聯膽汁酸受體1(TGR5)激活對高糖誘導小鼠心肌細胞肥大的影響。方法 原代培養小鼠心肌細胞，將細胞分為對照組、高糖組、高糖+INT-777(TGR5受體激動劑)組、高糖+INT-777+TGR5 shRNA(以TGR5干擾慢病毒包裝)組。采用圖像分析系統測定各組細胞表面積，通過RT-PCR及Western blotting方法檢測TGR5干擾慢病毒效率，RT-PCR檢測各組促肥大因子(心房鈉尿因子、β-肌球蛋白重鏈)mRNA表達變化。結果 成功培養小鼠心肌細胞。與對照組比較，高糖組心肌細胞表面積及促肥大因子mRNA表達增加(P均<0.05)。激活TGR5后，由高糖導致的心肌細胞表面積及促肥大因子mRNA表達的增加受到抑制(P均<0.05)。與激活TGR5組比較，干擾TGR5基因后，心肌細胞表面積及促肥大因子mRNA表達明顯增加(P均<0.05)。結論 激活TGR5受體可以抑制高糖誘導的心肌細胞肥大及促肥大因子mRNA表達，可能是糖尿病性心肌病重要的藥物治療靶點。

心肌細胞肥大；G蛋白偶聯膽汁酸受體；高糖誘導；INT-777；心房鈉尿因子；β-肌球蛋白重鏈；小鼠

長期的糖尿病可導致糖尿病性心肌病，患者出現心肌肥厚及心肌纖維化，最終出現心力衰竭、惡性心律失常甚至死亡[1]。G蛋白偶聯膽汁酸受體1(TGR5)是一種新型的調節機體能量代謝的“開關”，對血脂異常、肥胖、糖尿病等代謝性疾病有重要調控作用。近來大量研究表明，TGR5可能是各種代謝性疾病治療的重要藥物靶點[2,3]。但尚未見其在糖尿病性心肌病方面的相關研究報道。2015年3月～2016年3月，我們以小鼠心肌細胞為研究對象，給予高糖刺激，運用TGR5干擾慢病毒，檢測心肌細胞表面積、細胞總蛋白、心房鈉尿因子(ANF)及β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)表達變化，進而探討TGR5在高糖誘導心肌細胞肥大中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 出生0～3 d的乳小鼠、雌雄不限、SPF級(西南醫科大學實驗動物中心提供)，TGR5抗體(Santa Cruz Biotechnology)，RT-PCR試劑盒、RT-PCR合成引物(大連寶生物工程有限公司)，INT-777(Med Chem Express)，澳洲胎牛血清(BOVOGEN)，多聚賴氨酸、DMEM/F12培養基(Hyclone)，葡萄糖(Sigma)，Ⅱ型膠原酶(GIBICO)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Sigma)，α-actinin、免疫組化試劑盒(博士德)，胰酶、蛋白酶抑制劑、蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAPI (Beyotime )。

1.2 心肌細胞的原代培養及分組 小鼠心肌細胞的原代培養參照我們之前的實驗方法進行[4]，并將心肌細胞隨機分為四組。對照組：給予5 mmol/L 葡萄糖培養48 h；高糖組：給予33 mmol/L葡萄糖培養48 h；高糖+INT-777組：同時加入高糖33 mmol/L及TGR5特異性激動劑INT-777 30 μmol/L，培養48 h；高糖+INT-777+TGR5 shRNA組：先給予TGR5干擾慢病毒感染細胞后(TGR5 shRNA由上海漢恒生物科技有限公司設計并合成，以慢病毒包裝)，再加入高糖及INT-777培養48 h。

1.3 心肌細胞表面積和總蛋白測定 每組隨機選取6個視野，每個視野選取10個細胞，利用圖像分析軟件描記和測量單個細胞的表面積。去除培養液，用PBS液清洗3遍，加入蛋白裂解液裂解細胞，離心后取上清，采用BCA法測量各組總蛋白含量。

1.4 細胞 TGR5、ANF、β-MHC基因表達檢測 參照此前文獻報道的RT-PCR方法進行[5]。各組細胞經干預后，提取總RNA，逆轉錄后參照試劑盒說明書進行操作。TGR5基因：上游引物：5′-CTCATCGTCATCGCACC-3′；下游引物：5′-GCAAGCAGGGAAAGGAAACA-3′。ANF基因：上游引物：5′-TGGGCTTCTTCCTCGTCTT-3′；下游引物：5′-TCCAGGTGGTCTAGCAGGTT-3′。β-MHC基因：上游引物：5′-CTGTCCGTGCAATGACGA-3′；下游引物：5′-GCTGGTGTTCTGCGAGTGC-3′。GAPDH基因：上游引物：5-′TGCTGTCCTGTATGCCTCTG-3′；下游引物：5′-TTGATGTCACGCACGATTTCC-3′。以GAPDH為內參，結果以目的基因與GAPDH基因的比值表示。

1.5 細胞TGR5蛋白表達檢測 參照我們此前實驗的Werstern blotting方法進行[6]。細胞干預24 h后提取各組心肌細胞總蛋白，測定樣品濃度，灌膠并上樣后，電泳槽電泳，轉膜，加入一抗及二抗后用凝膠掃描成像，進行圖像分析。

2 結果

2.1 TGR5干擾慢病毒小鼠心肌細胞TGR5 mRNA及蛋白表達 對照組TGR5 mRNA及蛋白表達分別為1.67±0.05、1.84±0.07，高糖+INT-777+TGR5 shRNA組TGR5 mRNA 及蛋白表達分別為0.51±0.05、0.60±0.04。與對照組比較，高糖+INT-777+TGR5 shRNA組TGR5 mRNA 及蛋白表達均減少(P均<0.05)。

2.2 四組小鼠心肌細胞表面積和總蛋白 與對照組比較，高糖組心肌細胞表面積明顯增大，總蛋白含量明顯增加(P均<0.05)。與高糖組比較，高糖+INT-777組心肌細胞表面積減小，總蛋白含量明顯減少(P均<0.05)。與高糖+INT-777組比較，高糖+INT-777+TGR5 shRNA組心肌細胞表面積增大，總蛋白含量增加(P均<0.05)。見表1。

表1 四組小鼠心肌細胞表面積和總蛋白比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，**P<0.05；與高糖+INT-777組比較，△P<0.05。

2.3 四組小鼠心肌細胞ANF及β-MHC mRNA表達 與對照組比較，高糖組心肌細胞ANF及β-MHC mRNA表達明顯增加(P均<0.05)。與高糖組比較，高糖+INT-777組心肌細胞ANF及β-MHC mRNA表達明顯減少(P均<0.05)。與高糖+INT-777組比較，給予TGR5干擾慢病毒后，ANF及β-MHC mRNA表達增加(P均<0.05)。見表2。

3 討論

糖尿病性心肌病是糖尿病的常見并發癥，心肌肥厚是其主要特征之一。心肌肥厚主要表現為心肌細胞體積增大、蛋白蓄積和促肥厚基因表達增加等[7]。既往研究表明，高糖、血管緊張素Ⅱ等多種因素均能誘導心肌細胞肥大、蛋白質合成及促肥厚基因的表達增加[8～10]。此前文獻報道用高糖(33 mmol/L葡萄糖)培養心肌細胞48 h能導致心肌細胞肥大[11]。本研究給予心肌細胞以高糖培養從而建立糖尿病心肌病離體細胞模型。結果發現，高糖培養乳小鼠心肌細胞48 h，心肌細胞表面積及細胞總蛋白明顯增加，并且引起心肌細胞內促肥厚因子ANF及β-MHC的表達增加，表明在此條件下高糖能成功誘導心肌細胞肥大，與既往研究報道的刺激條件一致。

表2 四組小鼠心肌細胞ANF及β-MHC mRNA表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，**P<0.05；與高糖+INT-777組比較，△P<0.05。

TGR5是一種調節機體能量代謝的G蛋白偶聯的膽汁酸受體。一系列的動物實驗研究表明，激活TGR5能增加體內的能量輸出、調節脂肪代謝，減輕體質量；改善胰島素抵抗；改善血管炎癥反應、損傷狀態；延緩動脈粥樣硬化的發展等[12～13]。因此，TGR5也可能在高糖誘導的心肌細胞肥大的過程中發揮作用。TGR5天然激活劑為膽汁酸，但其特異性較差，故本實驗采用TGR5特異性半合成激動劑INT-777，其毒性低，且效價及選擇性較高，可以排除對其他膽汁酸受體的影響。同時，我們在此基礎上采用TGR5干擾慢病毒，能更特異性地顯示出TGR5的作用。本研究發現，TGR5特異性激動劑INT-777明顯抑制高糖導致的心肌細胞表面積、總蛋白及ANF、β-MHC mRNA表達增加，提示TGR5激活能改善高糖誘導的心肌細胞肥大。此后給予TGR5干擾慢病毒后，明顯取消了INT-777對高糖誘導的心肌細胞肥大的改善作用，從而再次證明TGR5激活能改善高糖誘導的心肌細胞肥大。

綜上所述，本研究初步探討了激活TGR5在高糖誘導的心肌細胞肥大中的作用，發現激活TGR5能減輕高糖導致心肌細胞肥大，但其具體作用機制仍需進一步探討。

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Effect of G-protein-coupled bile acid receptor 1 activation on high glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy in mice

FENGJian1,WUDan,CHENXuxin,LIUYingcai,LIJiafu

(1TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the effect of G-protein-coupled bile acid receptor 1 (TGR5) receptor activation on high glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy in mice.Methods After primary culture of mouse cardiomyocytes,the cells were divided into the control group,high glucose group,high glucose + INT-777 (the agonist of TGR5 receptor) and high glucose + INT-777+TGR5 shRNA group.Image analysis system was used for determination of cell surface area,RT-PCR and Western blotting were used to detect the lentivirus efficiency of TGR5 interference,and the expression of pro-hypertrophy genes was detected by RT-PCR.Results The mouse cardiomyocytes were successfully cultured.Compared with the control group,cardiomyocytes′ surface area and pro-hypertrophy gene mRNA expression increased in the high glucose group (allP<0.05).TGR5 activation inhibited the increase of cardiomyocytes′ surface area and pro-hypertrophy gene mRNA expression which was induced by high glucose (allP<0.05).Compared with high glucose+INT-777 group,cardiomyocytes′ surface area and pro-hypertrophy gene mRNA expression increased significantly after TGR5 gene interference (allP<0.05).Conclusion TGR5 receptor activation can inhibit cardiomyocyte hypertrophy and pro-hypertrophy gene mRNA expression induced by high glucose,which may be an important drug target for diabetic cardiomyopathy.

cardiomyocyte hypertrophy; G-protein-coupled bile acid receptor; high glucose induction; INT-777; atrial natriure factor; β-myosin heavy chain； mice

國家自然科學基金資助項目(31300946)。

馮健(1982-)，男，副主任醫師，博士，主要從事冠心病診治的基礎與臨床研究。 E-mail：415623fj@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.001

R542.2

A

1002-266X(2017)01-0001-03

2016-07-30)