阿司匹林對人結(jié)腸癌細胞中腫瘤干細胞標記物CD44表達的影響

陳小燕　吳應強　朱蓉

【摘要】 目的：觀察阿司匹林對人結(jié)腸癌腫瘤干細胞標志物CD44的影響，以探討其對結(jié)腸癌干細胞的作用。方法：Western blot檢測不同濃度阿司匹林作用后CD44在人結(jié)腸癌細胞株HT-29和SW480中的表達情況。結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示腫瘤干細胞標志物CD44在人結(jié)腸癌細胞株HT-29和SW480中均有表達，阿司匹林能降低HT-29和SW480中CD44蛋白的表達，并具有良好的量-效關系（P<0.05）；兩種細胞中CD44蛋白的表達比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：阿司匹林能降低結(jié)腸癌細胞株HT-29和SW480中CD44的表達，并對結(jié)腸癌腫瘤干細胞有抑制作用。

【關鍵詞】 阿司匹林； 結(jié)直腸癌； 腫瘤干細胞標志物； CD44； HT-29； SW480

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Aspirin on the expression of cancer stem cell marker CD44 in human colon cancer.Method：Western blot was used to detect the expression of CD44 in human colon cancer cell line HT-29 and SW480 after different concentrations of Aspirin.Result：Western blot showed that cancer stem cell marker CD44 expression in both HT-29 and SW480 human colon cancer cell lines，Aspirin could reduce the expression of CD44 HT-29 and SW480，it had a good dose-response relationship（P<0.05）.The expression of CD44 protein in two cells showed no significant difference（P>0.05）.Conclusion：Aspirin can reduce the expression of CD44 in colon cancer cell line HT-29 and SW480，inhibit the proliferation of colon cancer stem cells.

【Key words】 Aspirin； Colorectal cancer； Cancer stem cell marker； CD44； HT-29； SW480

First-authors address：The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563099，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.01.001

結(jié)直腸癌是全球第三大最常見的惡性腫瘤，也是導致癌癥死亡的主要原因[1]。腫瘤干細胞雖然只占結(jié)直腸癌組織一小部分，但其具有自我更新的能力，并在腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用，因而是腫瘤根治的靶點。CD44是Wnt通路的靶基因[2]，CD44在結(jié)直腸癌中高表達，可作為結(jié)直腸癌干細胞標志物[3-4]，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關，可能成為一個潛在的治療靶點。非甾體抗炎藥（NSAIDs）阿司匹林因具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用，在臨床十分常用，且研究顯示可以通過降低腺瘤和結(jié)直腸癌發(fā)生的風險，從而有效預防結(jié)直腸癌發(fā)生[5]，抑制甚至逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌癌前病變，延長患者的壽命[6]。本研究小組前期實驗結(jié)果表明阿司匹林可顯著降低HT-29（COX-2高表達）、SW-480（COX-2陰性表達）細胞系中的腫瘤標志物CD133、Lgr5的表達[7-8]。阿司匹林對腫瘤干細胞標志物CD44有何影響，目前尚不清楚。本實驗擬通過研究阿司匹林對人結(jié)腸癌細胞株HT-29和SW-480中腫瘤干細胞標記物CD44表達影響，進一步探討阿司匹林預防結(jié)直腸癌發(fā)生的可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株HT-29和SW-480人結(jié)腸癌細胞株。

1.2 主要試劑 McCoyS 5a培養(yǎng)基、胰蛋白酶及阿司匹林（美國Sigma公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒及RIPA裂解液（武漢博士德公司），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG及小鼠抗人β-actin（北京中杉金橋公司），小鼠抗人CD44單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞的培養(yǎng) 用10%胎牛血清的McCoyS 5a培養(yǎng)基培養(yǎng)HT-29、SW480細胞株，置于37 ℃，

5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長至80%～90%融合時，用細胞消化夜進行消化傳代。細胞處于對數(shù)期時、生長狀態(tài)良好時可用于實驗。

1.3.2 Western blot檢查HT-29、SW-480細胞中CD44表達 將HT-29、SW480細胞培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的阿司匹林（0、2.5、5.0、10.0 mmol/L）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別記為對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組。收集各濃度處理后的細胞，按RIPA方案提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，定量上樣后電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h。加入小鼠抗人CD44單克隆抗體、小鼠抗人β-actin一抗，4 ℃過夜，0.1% TBST漂洗10 min×3次，于室溫與辣根酶標記山羊抗小鼠IgG孵育1 h，0.1% TBST漂洗漂洗10 min×3次。應用Luminol顯色，暗室X線膠片曝光拍照，用凝膠圖象分析系統(tǒng)進行結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組內(nèi)的比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，在HT-29和SW480細胞中，各組的CD44蛋白印記條帶顏色由深到淺，見圖1。在HT-29細胞中，CD44蛋白的校準值均低于對照組；SW480細胞中，CD44校準值均亦低于對照組，各濃度組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。兩種細胞的組間相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖2。

3 討論

目前，腫瘤干細胞理論的提出為腫瘤研究提供了新的方向，腫瘤干細胞主導了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移[9]。干細胞亞群增多使腫瘤細胞對放化療的抵抗能力增強，導致了腫瘤復發(fā)以及癌癥死亡率增高等[10]，因此，腫瘤干細胞可作為徹底根治腫瘤的靶點[11]。

細胞表面跨膜糖蛋白分子CD44是粘附分子中重要成員，在淋巴細胞、單核細胞、紅細胞、上皮細胞等多種細胞以及在結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤中分布，主要參與細胞-細胞、細胞-基質(zhì)之間的特異性粘連過程。CD44根據(jù)其外顯子的轉(zhuǎn)錄片段是否參與選擇性拼接，可分成CD44s和CD44v。CD44v主要功能體現(xiàn)在機體的病理過程中，尤其是CD44v6[12]和CD44v9[13]，可以使腫瘤侵襲能力上升，可能是因為其改變了腫瘤細胞表面粘附分子的構(gòu)成和功能。

CD44作為結(jié)直腸癌干細胞的標志物得到了有關學者的證實，Wang等[14]通過分選出人結(jié)腸癌細胞株SW620中CD44+CD133-的細胞，其更好的代表了結(jié)腸癌干細胞，因其具有集落形成、增殖力強、抗凋亡以及誘導細胞耐藥等干細胞的特性。Du等[15]研究顯示從結(jié)腸癌患者分離出的CD44+腫瘤細胞，僅需100個就能夠發(fā)展成異質(zhì)性腫瘤，而且由單個CD44+腫瘤細胞形成的球體具有腫瘤細胞的多種層次結(jié)構(gòu)。這些研究表明CD44是結(jié)腸癌腫瘤干細胞最重要的表面生物學標志物之一，結(jié)直腸癌中，CD44顯著表達[16-18]，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移以及預后密切相關。Chai等[17]運用免疫組化檢測CD44在145例不同病理類型標本中的表達，結(jié)果顯示CD44在結(jié)腸癌組織中的表達率為95.65%，顯著高于正常黏膜5%、炎性增生性息肉22.58%、管狀腺瘤性息肉55.26%及絨毛狀息肉75.76%，CD44表達強度與腸息肉癌變進展呈正相關。Jing等[3]研究結(jié)果指出結(jié)腸癌伴肝轉(zhuǎn)移時，CD44基因表達量最高，其次是結(jié)腸癌和正常黏膜，其差異有統(tǒng)計學意義，CD44基因表達量與腫瘤位置、組織學有關，這與Du的研究結(jié)果不謀而合[15]，并提出CD44可以作為用于預測結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移及判斷結(jié)腸癌患者生存率更可靠的標記物。Bendardaf等[19]研究發(fā)現(xiàn)CD44s和CD44v6在結(jié)直腸中高表達，原發(fā)腫瘤比轉(zhuǎn)移瘤更高，這點與Hong的研究結(jié)果相似，轉(zhuǎn)移瘤中CD44s的表達程度與腫瘤組織學分級和原發(fā)腫瘤的侵襲性成正相關，與無病生存期成反比。Du等[20]研究表明CD44+腫瘤細胞通過表達朊病毒蛋白（PrPc）而增強結(jié)腸腸癌轉(zhuǎn)移的風險。此外，有研究顯示CD44基因微小RNA結(jié)合位點的功能性遺傳變異可以中國人群罹患結(jié)直腸癌的遺傳易感性[21]。有關于CD44與結(jié)腸癌患者生存期的關系問題，也有學者提出了不一樣的觀點，即CD44表達和患者的總生存期或無病生存期之間沒有相關性[22-23]，甚至呈負相關[18]，可能是由于腫瘤干細胞標志物對結(jié)直腸癌預后的影響取決于腫瘤的病理分型。

一系列研究均表明服用阿司匹林等NSAIDs可以降低結(jié)直腸癌的發(fā)病風險，改善患者預后，減少術(shù)后復發(fā)率以及降低癌癥死亡風險等[24]。本小組前期實驗結(jié)果顯示阿司匹林均能顯著降低人結(jié)腸癌細胞株HT-29、SW-480中腫瘤標志物CD133、Lgr5的表達，從而抑制腫瘤干細胞，其機制主要涉及機制COX-2途徑和非COX-2途徑，且以非COX-2途徑為主。然而其對腫瘤干細胞標志物CD44有何影響尚不清楚，需待進一步研究。本研究結(jié)果顯示HT-29、SW-480細胞株中均表達CD44，Muraro等[25]研究結(jié)果與此一致。此外，隨著阿司匹林濃度的增加，HT-29和SW480細胞中CD44的表達明顯減少，并呈量-效關系，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。有研究表明阿司匹林等NSAIDs可能抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而干預癌癥發(fā)生的初始步驟[26]。阿司匹林等NSAIDs可以減弱β-catenin/TCF敏感基因CD44的轉(zhuǎn)錄，并呈量效關系[26]，這與本實驗研究結(jié)果不謀而合。Zeilstra等[27]研究亦顯示與CD+/+/ApcMin/+小鼠比較而言，CD44-/-/ApcMin/+小鼠通過促進隱窩基底部上皮細胞的凋亡從而減少了50%的結(jié)腸腺瘤發(fā)生率，此研究表明，CD44在腸道腫瘤的發(fā)生中起了重要作用，同時也表明CD44并不影響細胞增殖而是維持腸道隱窩細胞凋亡與生長之間的平衡。CD44表達降低不僅可以降低結(jié)腸癌的發(fā)生，而且可以減少結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移[28]。CD44在腸上皮細胞及結(jié)直腸癌的表達是不依賴于p53，由此表明CD44可以作為結(jié)直腸癌治療的靶點[29]。

綜上所述，公認的結(jié)直腸癌干細胞標志物CD44在結(jié)腸癌中大量表達，其表達水平與腫瘤分化程度、分期和腫瘤部位等密切相關，反應了腸息肉癌變進展過程，可以獨立判斷患者預后[30-32]。本研究結(jié)果表明阿司匹林可抑制CD44的表達，可能是通過削弱CD44介導的Wnt信號而抑制腫瘤干細胞，從而起到防治結(jié)直腸癌的作用，為阿司匹林預防結(jié)直腸癌提供了相關實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2016-09-19） （本文編輯：周亞杰）