轉錄因子增強子結合蛋白-4基因沉默對子宮內膜癌細胞凋亡的影響

別延紅，李納，吳又明，王金生，耿文靜，藍海龍，陳光輝

(中山市小欖人民醫院，廣東中山 528415)

轉錄因子增強子結合蛋白-4基因沉默對子宮內膜癌細胞凋亡的影響

別延紅，李納，吳又明，王金生，耿文靜，藍海龍，陳光輝

(中山市小欖人民醫院，廣東中山 528415)

目的 觀察內源性轉錄因子增強子結合蛋白-4(AP-4)沉默對子宮內膜癌細胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。方法 將人子宮內膜癌細胞(HEC-1-A和RL95-2)分為NC組、si#1組、si#2組，si#1組轉染si-TFAP4片段1，si#2組轉染si-TFAP4片段2，NC組轉染對照siRNA。采用Hoechest 33258染色觀察凋亡核形態，采用Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術測算細胞凋亡率，采用real-time PCR技術檢測存活素(Survivin)mRNA表達，采用生物信息學分析預測Survivin編碼基因BIRC5的啟動子區域內是否存在AP-4的結合位點，采用染色體免疫共沉淀技術驗證AP-4是否結合到BIRC5的啟動子區域，采用雙熒光素酶報告系統檢測BIRC5的啟動子轉錄激活情況。結果 在HEC-1-A、RL95-2細胞中，與NC組相比，si#1組、si#2組凋亡核型細胞數均增加，細胞凋亡率均增加，Survivin mRNA相對表達量均減少(P均<0.05)。BIRC5的啟動子區域內存在一個高置信度的AP-4結合位點，沉默HEC-1-A、RL95-2細胞內源性AP-4后能降低AP-4對BIRC5啟動子區域的結合并抑制其轉錄激活狀態。結論 沉默內源性AP-4能誘導子宮內膜癌細胞凋亡，其機制可能為降低了AP-4對Survivin的轉錄激活，從而誘導了腫瘤細胞的凋亡。

轉錄因子增強子結合蛋白-4；子宮內膜癌；存活素；細胞凋亡

近年來，子宮相關惡性腫瘤的發病率呈上升趨勢[1]，這可能與人們生活習慣與飲食結構改變、非正規的激素代替治療和性激素濫用等因素有關[2]。子宮內膜癌對我國女性健康的威脅日益加深，研究其相關發病機制、尋找更為有效的診斷標記物及潛在的治療靶點成為研究熱點。轉錄因子增強子結合蛋白-4(AP-4)是近年來發現的一個重要的轉錄調控因子，屬于堿性螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈(bHLH-LZ)轉錄因子家族成員。研究[3]發現，AP-4能結合于病毒40(SV40)的增強子序列，并與轉錄因子AP-1協同增加SV40病毒晚期基因的轉錄，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及免疫應答等過程[4～8]。近年研究證實，AP-4在多種腫瘤如肺癌[5]、胃癌[9]、結直腸癌[10]、肝癌[11]和乳腺癌[12]等組織中高表達。本課題組前期研究證實，AP-4在子宮內膜癌腫瘤組織中高表達，沉默AP-4能抑制子宮內膜癌細胞的惡性增殖[13]。2016年2～6月，本課題組進一步利用子宮內膜癌細胞的體外模型，通過小干擾RNA(siRNA)技術，觀察內源性AP-4沉默對子宮內膜癌細胞凋亡的影響，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器 人子宮內膜癌細胞(HEC-1-A和RL95-2)購自中國科學院細胞庫，并由本實驗室規范傳代保存。RPMI1640培養液、Opti-MEN培養液、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶液、丙酮酸鈉溶液、TRIzol試劑、TFAP4 Stealth Select RNAi 2個siRNA片段及對應的siRNA Negative Control購自Invitrogen公司。Hoechest33258購自阿拉丁公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物科技有限公司。PrimeScrip 反轉錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq 定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。SimpleChIP酶解法染色體免疫共沉淀試劑盒購自Cell Signaling Technology公司。AP-4兔抗人一抗和及Pokemon兔抗人一抗購自Novus公司。CFX96實時熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產品；Gallios流式細胞儀為Beckman Coulter公司產品。

1.2 細胞培養及分組 人子宮內膜癌細胞(HEC-1-A和RL95-2)完全培養基組成為RPMI1640培養液(添加1.5 g/L NaHCO3、0.11 g/L丙酮酸鈉和10% FBS)；培養環境為5% CO2、37.5 ℃恒溫恒濕。將細胞分為NC組、si#1組、si#2組。

1.3 AP-4基因沉默 si#1組轉染si-TFAP4片段1，si#2組轉染si-TFAP4片段2，NC組轉染對照siRNA。如文獻[14]所述進行針對AP-4的siRNA轉染，當細胞生長至70%時，更換新的完全培養基，同時分別用Opti-MEN培養液按比例稀釋Lipofectamine 2000及siRNA并混勻，靜置5 min后滴加入細胞上清中，使siRNA濃度為100 nmol/L，根據后續實驗，確定轉染時間。此外，2個siRNA片段對AP-4的沉默效率見文獻[13]。

1.4 各組細胞凋亡核型觀察及計數 采用Hoechest 33258染色法。按實驗分組處理后，棄除培養液，用PBS緩沖液洗滌細胞，加入0.5 mg/L Hoechest 33258染液避光染色20 min，采用倒置熒光顯微鏡觀察拍照，每組細胞在200×視野中隨機選取5個視野，計數典型的凋亡核型細胞(熒光增強，細胞核縮小碎裂，呈大小不等的圓形、花瓣狀或不規則塊狀)，測算凋亡核型細胞率。每次實驗設3個復孔，每組實驗重復3次以上。

1.5 各組細胞凋亡率測算 采用Annexin V-FITC檢測凋亡細胞。參考文獻[15]報道按產品說明書操作，離心棄上清并用PBS洗滌細胞，按每1×106細胞加入500 μL結合緩沖液重懸細胞后，加入10 μL Annexin V-FITC染液混勻室溫避光孵育10 min，再加入10 μL PI染液混勻后冰浴。隨即進行流式細胞分析儀檢測，調整并收集每個樣品的前散射光(FSC)、側散射光(SSC)、綠光(Annexin V-FITC)和紅光(PI)四個通道的信號，并以FSC/SSC作散點圖圈出主細胞群，再以Annexin V-FITC/PI對主細胞群做圖分出Annexin V-FITC陽性、PI陰性或陽性的凋亡細胞群，除以總細胞群得到每組細胞的凋亡率。每次實驗設3個復孔，每組實驗重復3次以上。

1.6 各組細胞存活素(Survivin)mRNA檢測 按文獻[16]報道所述采用real-time PCR檢測Survivin mRNA，用TRIzol裂解上述三組HEC-1-A、RL95-2細胞，氯仿萃取異丙醇沉淀RNA。隨后按PrimeScript RT reagent Kit說明書操作，進行反轉錄。按SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit說明書操作，在CFX96實時定量PCR系統上，選用2-ΔΔCt相對定量法檢測分析，其中選用空白組為對照，內參基因為ACTB，求算各目標基因的相對mRNA表達量。每次實驗設3個復孔，每組實驗重復3次以上。Survivin上游引物為5′-CTTTCTCCGCAGTTTCCTCA-3′，下游引物為5′-TTGGTGAATTTTTGAAACTGA-3′，ACTB的上游引物為5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物為5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

1.7 AP-4與BIRC5啟動子的關系驗證

1.7.1 AP-4與BIRC5啟動子區的結合效能預測 采用生物信息學分析方法進行預測。參考文獻[17,18]報道，Survivin的編碼基因(BIRC5)及轉錄本信息從美國國家生物技術信息中心(NCBI)的人類基因組信息庫獲得。人類19版基因組(hg19)的BIRC5啟動子區域的堿基序列從UCSC人類基因組數據庫中獲得，物理位置為17號染色體的76 209 000～76 211 500位，其中轉錄激活標記——組蛋白H3第27位組氨酸的乙酰化(H3K27Ac)的染色體免疫共沉淀測序(ChIP-seq)數據及DNA元件百科全書項目(ENCODE)中161個轉錄因子的ChIP-seq數據均直接從該瀏覽器數據庫中獲取。利用JASPAR 2016數據庫中收錄的人AP-4轉錄因子識別基序(MA0691.1)，預測BIRC5啟動子區中AP-4的結合位點，相對吻合評分閾值設定為95%。

1.7.2 AP-4在BIRC5啟動子區中富集率檢測 采用染色體免疫共沉淀法。BIRC5啟動子結合區域上游引物為5′-TTCCACCCTCATTGCTCTTCTT-3′，下游引物為5′-CATCTTACGTCCACCCAAG-3′。IRC5啟動子非結合區域上游引物為5′-AATTAGCCTGTGTGGTGGT-3′，下游引物為5′-GTGCAGTGGCATGATCTCAG-3′。參考文獻[17]報道，按實驗要求處理細胞后，甲醛交聯、甘氨酸調節pH值；利用SimpleChIP試劑盒內的裂解緩沖液提取出細胞核組分；利用微球菌核酸酶消化DNA至150～900 bp的片段，隨后將樣品分為Input組分(50 μL)和IP組分(1 mL)；往IP組分加入抗AP-4一抗4 ℃旋搖過夜，再加入磁珠偶聯的蛋白G進行免疫共沉淀；隨后將Input組分和IP組分用蛋白酶K處理進行解交聯，并用離心柱法提取解交聯后的DNA片段。最后，利用real-time PCR檢測樣品中目標DNA片段的反應循環閾值(Ct)，計算每組的DNA片段富集率(%)。DNA片段富集率(%)=1/2[4.32+CT(IP)-Ct(Input)]×100%。每次實驗設3個復孔，每組實驗重復3次以上。

1.7.3 AP-4與BIRC5啟動子區的結合效能檢測 采用雙熒光素酶報告基因檢測。按文獻[17,19]報道所述，利用人子宮內膜癌細胞HEC-1-A的基因組DNA為模板，利用BIRC5啟動子區域的克隆引物(上游引物為5′-GTGCAGTCAACGATGTACTG-3′，下游引物為5′-CACTTCAAAGGGTAATTTT-3′)，在KOD高保真酶反應體系中擴增目標序列，水平電泳后回收含目的基因的條帶；再利用KpnⅠ及BgⅢ處理插入片段及pGL6-TA-luc質粒，并在T4連接酶體系中構建重組質粒；轉化入DH5?感受態細胞，涂板挑取克隆測序，將插入序列正確的質粒命名為pGL6-TA-luc-BIRC5-promoter。按文獻[17,19]報道所述，將pRL-SV40-N質粒與構建好的pGL6-TA-luc-BIRC5-promoter質粒按1∶10，并與siRNA同時轉染入細胞。正常培養24 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒在Synergy2多功能酶標儀上檢測各組的螢火蟲熒光素活性及海腎熒光素酶活性，并按下列公式計算si#1組、si#2組相對熒光強度。每次實驗設3個復孔，每組實驗重復3次以上。

2 結果

2.1 各組凋亡核型細胞率比較 NC組、si#1組、si#2組HEC-1-A細胞凋亡核型細胞率分別為0.78%±0.67%、3.89%±1.05%、3.78%±0.67%，RL95-2細胞凋亡核型細胞率分別為1.11%±0.60%、4.22%±0.97%、5.00%±1.12%，si#1組、si#2組與NC組相比P均<0.05。

2.2 各組細胞凋亡率比較 NC組、si#1組、si#2組HEC-1-A細胞凋亡率分別為3.40%±1.02%、9.31%±1.73%、10.12%±1.42%，RL95-2細胞凋亡率分別為2.95%±0.42%、9.15%±1.28%、9.55%±2.32%，si#1組、si#2組與NC組相比P均<0.05。

2.3 各組細胞Survivin mRNA表達比較 NC組、si#1組、si#2組HEC-1-A細胞Survivin mRNA相對表達量分別為1.00±0.19、0.34±0.07、0.24±0.05，RL95-2細胞Survivin mRNA相對表達量分別為1.00±0.15、0.38±0.06、0.35±0.04，si#1組、si#2組與NC組相比P均<0.05。

2.4 AP-4與BIRC5啟動子區的結合效能預測結果 BIRC5的啟動子區域存在AP-4的結合位點，相對吻合評分為99.7%。BIRC5基因啟動子區域的第76 210 277位為轉錄啟始位點，76 210 300～76 211 400位見較強的H3K27Ac修飾信號，76 209 800～76 211 200位見ENCODE數據庫中多個轉錄因子的ChIP-seq信號(即轉錄因子識別簇)。同時該區域有一個AP-4的可能結合位點，位于76 210 987～76 210 996位(S1)，正好在H3K27Ac修飾區及轉錄因子識別簇內。

2.5 AP-4在BIRC5啟動子區中富集率結果 NC組、si#1組、si#2組HEC-1-A細胞BIRC5啟動子結合區域AP-4富集率分別為6.59%±1.02%、1.81%±0.01%、1.59%±0.24%，RL95-2細胞BIRC5啟動子結合區域AP-4富集率分別為8.55%±1.42%、1.88%±0.42%、1.77%±0.24%，si#1組、si#2組與NC組相比P均<0.05。NC組、si#1組、si#2組HEC-1-A細胞BIRC5啟動子非結合區域AP-4富集率分別為0.08%±0.01%、0.08%±0.01%、0.08%±0.02%，RL95-2細胞BIRC5啟動子非結合區域AP-4富集率分別為0.10%±0.02%、0.07%±0.01%、0.10%±0.02%，三組比較差異無統計學意義。

2.6 AP-4與BIRC5啟動子區的結合效能檢測結果 NC組、si#1組、si#2組HEC-1-A細胞相對熒光強度分別為1.00±0.17、0.44±0.10、0.51±0.19，RL95-2細胞相對熒光強度分別為1.00±0.18、0.35±0.07、0.41±0.08，si#1組、si#2組與NC組相比P均<0.05。

3 討論

子宮內膜癌高發于絕經后的婦女，常伴有陰道不規則出血等早期臨床癥狀，多數患者(約75%)確診時尚處于早期，手術或放射治療效果較好，預后較佳[2]。根治性手術是子宮內膜癌最主要的治療方法，此外，包括放療、化療和激素治療在內的綜合性治療方案也應用廣泛[20]。根據對激素治療的反應情況及病理特征，子宮內膜癌一般可以粗略分為兩種類型[21]。第一種類型的子宮內膜癌一般為低病理級別并高表達激素受體，其發病因素一般與肥胖及激素紊亂相關，腫瘤組織中的基因組穩定，關鍵基因的突變較少，對激素治療及放化療敏感，故總預后較好；而第二種類型的子宮內膜癌則為高病理級別且不表達激素受體，其腫瘤組織中的基因組不穩定，常見關鍵基因突變，但相關發病機制不清，因此對治療不敏感且預后較差[2]。近年來，針對第二種類型子宮內膜癌的研究逐漸增多，如何從分子機制揭示其發病過程及惡性進展成為熱點[22]。

轉錄因子AP-4的蛋白結構中包含了一個螺旋-環-螺旋結構域和兩個亮氨酸拉鏈模體，是參與DNA相互作用的區域，已證實AP-4能識別并結合于DNA上的E-box基序(CAGCTG)，并對靶基因起轉錄調控作用[4～8]。本課題組前期研究發現，轉錄因子AP-4在子宮內膜癌腫瘤組織中高表達，沉默AP-4后能顯著抑制子宮內膜癌細胞的惡性增殖，提示轉錄因子AP-4可能是一個潛在的治療靶點。Hu等[5]利用siRNA沉默肺癌細胞內源性AP-4，使腫瘤細胞發生G0/G1期阻滯并誘導凋亡發生，從而顯著抑制其體內成瘤。此外，Jackstadt等[23]進一步發現，轉錄因子AP-4能通過直接調控干性相關基因(LGR5、CD44)和上皮-間質轉化相關基因(SNAIL1、CDH1、VIM、CLDN1等)參與結直腸癌的轉移，沉默內源性AP-4能顯著抑制結直腸癌細胞體外遷移侵襲能力及體內的遠處轉移情況。但是，仍未見文章報道AP-4在調控子宮內膜癌細胞凋亡相關方面的靶基因。本研究在前期研究基礎上，利用siRNA技術沉默了子宮內膜癌細胞內源性AP-4的表達，觀察體外培養腫瘤細胞明顯出現了凋亡的核形態，并用Annexin V-FITC/PI染色法定量分析發現，沉默AP-4后子宮內膜癌細胞自發凋亡明顯增多，表明沉默AP-4能誘導子宮內膜癌細胞發生凋亡，提示轉錄因子AP-4不僅可以作為多種腫瘤的生物標志物，還可能成為治療包括子宮內膜癌在內的多種腫瘤的分子靶點。

Survivin是近年來發現的凋亡抑制蛋白家族成員，具有維持細胞有絲分裂周期和抑制細胞凋亡的功能。Survivin在生理情況下只表達于成人分泌期子宮內膜、胎盤、睪丸、胸腺和胚胎中，但在病理狀態下廣泛表達于包括子宮內膜癌在內的各種惡性腫瘤，以促進腫瘤的增殖并抑制其凋亡[24～26]。BIRC5基因是Survivin的編碼基因，轉錄因子對BIRC5啟動子區域調控影響了Survivin的表達水平。有研究[27]表明，轉錄因子STAT3能直接轉錄激活升高Survivin在子宮內膜癌細胞及組織的表達水平，那AP-4是否也能轉錄激活Survivin？在本研究中，我們首先利用生物信息學分析了Survivin的編碼基因BIRC5啟動子區域，發現該區域有一個潛在的可信度相當高的AP-4識別位點；進一步利用ChIP實驗證實，沉默內源性AP-4能降低AP-4對BIRC5啟動子區域的結合，表明AP-4能直接結合于BIRC5啟動子區域；最后利用雙熒光素酶報告基因實驗證實，沉默內源性AP-4能降低BIRC5啟動子區域的轉錄激活水平，表明AP-4能轉錄激活BIRC5。綜合上述實驗結果我們發現，在子宮內膜癌細胞中轉錄因子AP-4能直接轉錄激活BIRC5基因，從而使Survivin的表達上調。但要明確AP-4是否可作為治療子宮內膜癌的潛在靶點，目前的數據依然不夠充分，后續的回補實驗及體內功能驗證將是我們進一步的研究計劃。

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Effects of silencing transcription factor AP-4 gene on apoptosisof endometrial cancer cells

BIEYanhong,LINa,WUYouming,WANGJinsheng,GENGWenjing,LANHailong,CHENGGuanghui

(XiaolanPeople′sHospitalofZhongshan,Zhongshan528415,China)

Objective To investigate the effect of silencing transcription factor activating enhancer-binding protein 4 (TFAP-4) in vitro on apoptosis of endometrial cancer cells and its mechanism. Methods The human endometrial cancer cells (HEC-1-A and RL95-2 cells) were divided into NC group, si#1 group and si#2 group. The si#1 group and si#2 group were transfected with si-TFAP4 fragment 1 and si-TFAP4 fragment 2, respectively, and the NC group was transfected with control siRNA. The apoptosis was detected by Hoechest 33258 staining and the apoptosis rate by Annexin V-FITC/PI assay. The survivin (BIRC5) mRNA was detected by real-time PCR. Bioinformatics software was used to detect whether there were the AP-4 binding sites on the promoter of BIRC5. Chromatin immunoprecipitation was used to detect the binding between AP-4 and the promoter of BIRC5, and the dual-luciferase reporter gene assay was applied to detect the transcriptional activity of AP-4 on promoter of BIRC5. Results The number of apoptosis and the apoptosis rate in HEC-1-A and RL95-2 cells of the si#1 group and si#2 group was significantly increased, while the survivin mRNA expression was decreased as compared with that of the control group (allP<0.05). A high-confidence AP-4 binding site existed in the BIRC5 promoter region, and silencing AP-4 suppressed the binding of AP-4 on the promoter region of BIRC5, and suppressed the transcriptional activity of AP-4 on promoter of BIRC5. Conclusions Silencing AP-4 could induce the apoptosis of endometrial cancer cells through reducing the AP-4 on survivin transcription activation, and thereby inducing apoptosis of tumor cells.

transcription factor activating enhancer-binding protein 4; endometrial carcinoma; survivin; apoptosis

廣東省中山市科技局基金資助項目(2015B1022)。

別延紅(1986-)，女，住院醫師，主要研究方向為子宮內膜癌的分子診斷。E-mail: 408281168@qq.com

陳光輝(1973-)，男，主任技師，主要研究方向為免疫及分子診斷技術。E-mail: 931302869@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.002

R737.33

A

1002-266X(2017)02-0005-05

2016-09-19)