血漿microRNA-107和microRNA-99b-5p對精神分裂癥的診斷價值

彭瑛，馮莎莎，田剛，楊梅，鄧正華，王開正

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

血漿microRNA-107和microRNA-99b-5p對精神分裂癥的診斷價值

彭瑛，馮莎莎，田剛，楊梅，鄧正華，王開正

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

目的 探討血漿microRNA-107(miR-107)和microRNA-99b-5p(miR-99b-5p)對精神分裂癥的診斷價值。方法 收集90例初診精神分裂癥患者(精神分裂癥組)，90例雙相情感障礙患者(雙相情感障礙組)和90例體檢健康者(健康對照組)。采用實時熒光定量PCR法檢測各組血漿miR-107和miR-99b-5p；繪制受試者工作特征(ROC)曲線，采用logistic回歸分析法評價血漿miR-107和miR-99b-5p對精神分裂癥的診斷價值。結果 精神分裂癥組血漿miR-99b-5p和miR-107表達低于雙相情感障礙組及健康對照組(P均<0.05)。miR-99b-5p和miR-107診斷精神分裂癥的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.923、0.744，特異性分別為91.1%、62.2%，靈敏性分別為81.7%、75.0%；二者聯合診斷的AUC為0.763，靈敏性和特異性分別為81.1%、87.2%。結論 miR-99b-5p是精神分裂癥良好的生物學標志物，miR-107診斷效果不及miR-99b-5p。

精神分裂癥；microRNA-107；microRNA-99b-5p；聯合診斷

精神分裂癥是一種由多個細胞信號通路異常調節所致的神經系統紊亂性疾病，包括多巴胺能信號、谷氨酸信號和神經可塑性信號通路異常等[1]。近年來精神分裂癥的發病率逐年增加[2]。目前精神分裂癥的診斷仍然依靠臨床癥狀，缺乏特異性生物標志物。近年來研究發現，microRNA(微小RNA，miRNA)在精神分裂癥的病理生理過程中發揮重要作用。由于循環miRNAs具有穩定性強、操作方便和患者已接受等優點，更具有研究價值。本研究觀察精神分裂癥患者血清miR-99b-5p和miR-107表達，進一步分析miRNAs與精神分裂癥的關系及其診斷價值，旨在為精神分裂癥的診斷提供靈敏、特異的實驗室指標。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年10月～2015年10月在西南醫科大學附屬醫院精神科初診為精神分裂癥的患者90例(精神分裂癥組)，其中男49例、女41例，年齡12～63(30.1±12.8)歲。納入標準：①根據美國精神障礙診斷與統計手冊第4版(DSM-V)診斷為精神分裂癥；②首次發病，未使用任何抗精神病藥物。排除標準：①患有其他精神疾患或藥物成癮者；②曾有腦部外傷致應激性失憶癥持續超過24 h者；③智力遲緩(IQ<70)者；④患運動障礙性疾病或電驚厥治療(6個月以內)者；⑤孕產婦。選擇同期90例診斷為雙相情感障礙患者(情感障礙組)，其中男41例、女49例，年齡18～65(33.2±13.1)歲。納入標準：①DSM-V診斷為雙相情感障礙，未使用任何抗精神病藥物。排除標準：同精神分裂癥組。選擇90例同期西南醫科大學附屬醫院門診體檢中心的體檢健康者(健康對照組)，自愿參與實驗；其中男43例、女47例，年齡20～51(30.1±6.11)歲。以上三組均為漢族人，樣本收集經本院倫理委員會批準，精神科醫師和護士協助采集，患者本人或家屬對研究內容知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血漿miR-99b-5p和miR-107表達檢測 各組均抽取清晨空腹靜脈血10 mL，EDTA-K2抗凝，3 000 r/min離心10 min。收集血漿于1.5 mL收集管中，再用離心力為16 000 g的高速冷凍離心機離心10 min，取上清移至另一收集管中，-80 ℃保存待用。血漿外參基因的制備：由于血漿中沒有穩定表達的內參基因，本試驗采用秀麗隱桿線蟲miR-39所制成的miRNAs合成物(C. elegans miR-39 miRNA mimic)作為外參基因，在提取過程中保證所有血漿樣本加入等量的該外參基因，以一管含量為10 pmol凍干粉的形式提供，按說明書進行稀釋制備外參基因。采用實時熒光定量PCR法檢測血漿miR-99b-5p和miR-107表達。血漿總RNA的提取和純化：按照說明書進行總RNA的提取和純化，對所有提取的RNA進行光密度(OD)值檢測，OD值在1.8～2.0之間說明純度較好，瓊脂糖電泳后再凝膠成像儀下進行完整性分析。OD值檢測結果顯示，本實驗所得的RNA提取物的純度較好(OD值為1.4～2.0)；瓊脂糖電泳后在凝膠成像儀下可見兩條清晰的28S和18S條帶，證實所提取的RNA具有較好的完整性。RNA反轉錄成cDNA：準備反轉錄體系，5×miScript HiSpec Buffer 4 μL，10×miScript Nucleics Mix 2 μL，無RNA酶水7 μL，miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μL，樣本RNA 5 μL，總體積 20 μL。按95 ℃ 反應5 min，37 ℃反應60 min進行反轉錄及擴增成cDNA。加入180 μL無RNA酶水稀釋cDNA，分裝保存。qRT-PCR反應：準備qRT-PCR反應混合液于96孔反應板中，2×QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix 10 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，10×miScript Primer Assay(引物)2 μL，無RNA酶水4 μL，模版DNA 2 μL，總體積20 μL。PCR擴增循環條件：90 ℃，15 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，70 ℃、30 s，共40個循環。ΔCt值為目的基因與外參基因Ct值之差，即(ΔCt=CtmiRNA-Ct外參)，以2-ΔCt代表各樣本miRNAs的相對表達量。

1.3 MiR-99b-5p和miR-107診斷精神分裂癥的效能分析 采用受試者工作特征(ROC)曲線和logistic回歸分析評價血漿miR-99b-5p和miR-107及二者聯合檢測對精神分裂癥的診斷效能。在ROC曲線下面積(AUC)>0.50的情況下，AUC值越大，越接近于1，診斷準確性越高[3]。

2 結果

2.1 血漿miR-99b-5p和miR-107表達 三組血漿miR-99b-5p和miR-107表達比較見表1。

表1 三組血漿miR-99b-5p和miR-107相對表達量比較±s)

注：與健康對照組比較，*P<0.01；與雙相情感障礙組比較，△P<0.01。

2.2 miR-99b-5p和miR-107對精神分裂癥的診斷價值 miR-99b-5p和miR-107診斷精神分裂癥的AUC分別為0.923、0.744，特異性分別為91.1%、62.2%，靈敏性分別為81.7%、75.0%；二者聯合檢測診斷的AUC為0.763，靈敏性和特異性分別為81.1%、87.2%。見圖1。

圖1 miR-99b-5p和miR-107診斷精神分裂癥的ROC曲線

3 討論

miRNA是一類長度21～25核苷酸片段的內源性非編碼的小分子RNA[4]，與生長發育、器官形成、細胞增殖凋亡、腫瘤形成和天然免疫等病理生理過程有關[5]。中樞神經系統含有非常豐富的miRNAs，在神經細胞的增殖、發育、分化和突觸塑形等方面起重要作用[6]。miRNA在血清(漿)中廣泛穩定的存在，并隨生理狀況、疾病的種類而變化[7]。

研究發現，miR-107在調節N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體誘導的鈣信號通路中有重要作用[8]。miR-107在精神分裂癥患者的背外側前額葉皮層上調，對NMDA受體亞基3A的非編碼區3′端有較強的調節作用，在參與神經連接和突觸可塑性的通路中高度富集，如軸突導向、長時程增強作用等[9]。Scarr等[10]研究發現，大腦顳上回皮層灰質區miR-107表達上調、miR-107可調控CHRM1基因表達。進一步說明miR-107參與了精神分裂癥的發病。目前尚缺乏miR-99b-5p與精神分裂癥的相關報道，但研究發現，miR-99家族在調節細胞存活、細胞應激反應、細胞增殖、血管生成、DNA損傷和傷口愈合等生理過程中發揮重要作用[11]。生物信息學分析發現，miR-99b-5p調控的直接靶基因包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)[12]；而mTOR與調節神經元的存活、神經保護、細胞自噬、突觸發育和功能神經系統以及和突觸重塑、長時程增強記憶和認知能力下降等有關[13,14]。精神分裂癥是以多種臨床癥狀和認知缺陷為特征的一種復雜的神經紊亂性疾病，涉及到神經網路和突觸功能的紊亂；據此分析miR-99b-5p也可能參與了精神分裂癥的發生。

目前尚缺乏精神分裂癥患者外周血miR-99b-5p和miR-107表達的相關研究。本研究miR-107和miR-99b-5p在精神分裂癥患者血漿中均呈低表達，二者可能與精神分裂癥發病機制存在著某些關聯，值得進一步探討。本研究統計分析發現，miR-99b-5p對精神分裂癥有較高的診斷價值，敏感性、特異性、準確性均高于miR-107。但多項研究均證實了miR-107與精神分裂癥有密切關系，Gardiner等[15]在精神分裂癥的外周血單個核細胞中發現miR-107低表達，本研究結果與其基本一致。miR-107低表達的可能機制為miRNA具有游走性[16]，從病變組織、器官釋放的miRNA可能先入血，再入外周血單核細胞。本研究miR-107診斷精神分裂癥的AUC雖低于miR-99b-5p，但仍存在診斷意義。研究發現，采用多個miRNAs對疾病狀態的預測精度高于單一的miRNA[17]。本研究對低表達miR-107、miR-99b-5p的定量資料進行聯合logistic回歸分析發現，二者聯合檢測診斷精神分裂癥的特異性、敏感性及AUC均高于miR-107單項檢測，說明聯合檢測可提高miR-107的診斷能力。本研究的不足之處：由于時間和經費的限制，樣本量偏少、研究對象范圍較小；只選擇了雙相情感障礙作為對照，抑郁癥等其他精神疾病未納入研究，故不能排除其他精神疾病患者亦存在miRNA的差異表達。今后的研究中將進一步擴大樣本量，進行循環miRNAs生物標志物診斷模型研究和特征miRNAs功能驗證試驗，以更深層次的闡明其在精神分裂癥中的作用機制。

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王開正(E-mail： 1136365404@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.034

R749

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1002-266X(2017)04-0098-03

2016-06-26)