糖尿病腎病患者血清抗衰老蛋白Klotho表達變化及意義

魯勤波，高艷青

(鄂鋼醫院，湖北鄂州436000)

糖尿病腎病患者血清抗衰老蛋白Klotho表達變化及意義

魯勤波，高艷青

(鄂鋼醫院，湖北鄂州436000)

目的 探討抗衰老蛋白Klotho在糖尿病腎病發生、發展中的作用。方法 選擇經腎組織活檢明確診斷為糖尿病腎病的患者126例，腎穿刺病理分型為Ⅰ級36例(觀察Ⅰ組)、Ⅱ級44例(觀察Ⅱ組)、Ⅲ級46例(觀察Ⅲ組)，同期無腎功能損傷的2型糖尿病患者45例作為對照組。比較各組一般資料、生化相關指標、腎小球硬化率(ROG)、血清單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、8-異前列腺素F2α(8-Iso-PGF2α)、TNF-α、轉化生長因子-β1(TGF-β1)水平及血清Klotho mRNA相對表達量。結果 各組性別、年齡、收縮壓、舒張壓、BMI、糖化血紅蛋白(HbA1C)和TC比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。觀察Ⅱ組和觀察Ⅲ組糖尿病病程均長于觀察Ⅰ組和對照組，且觀察Ⅲ組糖尿病病程更長(P均<0.05)。觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)均高于對照組，且觀察Ⅲ組升高最明顯(P均<0.05)。觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α、TGF-β1水平均高于對照組，血清Klotho mRNA相對表達量均低于對照組，且觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組尿蛋白、ROG逐漸升高，GFR逐漸降低，組間兩兩比較P均<0.05。糖尿病腎病患者血清Klotho mRNA相對表達量與糖尿病病程、尿蛋白、Scr、ROG及血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α和TGF-β1水平均呈負相關(r分別為-0.624、-0.751、-0.696、-0.708、-0.829、-0.895、-0.924和-0.795，P均<0.05)，與GFR呈正相關(r=0.702，P<0.05)。結論 糖尿病腎病患者血清Klotho表達水平降低，且與病情嚴重程度有關；Klotho可能通過抑制氧化應激、炎癥反應及腎間質纖維化而參與糖尿病腎病的發生、發展。

糖尿病腎病；2型糖尿病；Klotho；氧化應激；炎癥反應；腎間質纖維化

糖尿病腎病是導致糖尿病患者死亡的重要原因[1]。以往采用蛋白尿水平對患者病情進行臨床分級，并不能反映腎臟病變的真實情況，且無法排除其他以蛋白尿為主要表現的非糖尿病腎臟病變。臨床為對糖尿病腎病進行準確分級，明確病變的嚴重程度，越來越多的單純糖尿病腎病需行腎活檢。Klotho是調控衰老的相關基因，與多種疾病的發生、進展及預后密切相關[2，3]。Klotho具有抗氧化應激作用，可通過抑制炎癥反應而保護糖尿病患者的腎功能[3]，可作為預測性標志物[4]。目前臨床關于Klotho在糖尿病腎病發生、發展中的作用報道較少，為此我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年8月～2015年8月在我院住院治療的糖尿病腎病患者126例，男59例、女67例，年齡(54.2±6.4)歲。納入標準：①均為2型糖尿病[2]患者；②均行腎組織活檢以排除其他腎臟疾病，明確診斷為糖尿病腎病。排除標準：①1型糖尿病或繼發性糖尿病所致的糖尿病腎病者；②原發性或繼發性腎小球、腎小管、腎間質病變者；③近1個月出現糖尿病急性并發癥者；④急、慢性感染者，肝、腎、心臟功能障礙者，高血壓、惡性腫瘤患者，免疫系統疾病者；⑤妊娠或哺乳期婦女。根據腎組織活檢檢查結果，參照美國腎臟病學會關于糖尿病腎病病理分型標準[5]，Ⅰ級36例(觀察Ⅰ組)、Ⅱ級44例(觀察Ⅱ組)、Ⅲ級46例(觀察Ⅲ組)。選擇同期在我院內分泌科住院治療、無腎功能損傷的2型糖尿病患者45例作為對照組，男19例、女26例，年齡(55.0±6.7)歲。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 觀察指標

1.2.1 一般資料 記錄各組性別、年齡、糖尿病病程、血壓(收縮壓和舒張壓)、BMI。

1.2.2 生化相關指標 采用全自動生化儀檢測尿蛋白、糖化血紅蛋白(HbA1C)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、TC，計算腎小球率過濾(GFR)。

1.2.3 腎小球硬化率(ROG) 糖尿病腎病患者根據腎組織活檢結果計算ROG，ROG=硬化腎小球數/腎小球總數×100%。

1.2.4 炎癥、氧化應激相關指標 抽取各組晨起空腹靜脈血6 mL，于4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，取上清，保存于-80 ℃冰箱中備檢。采用ELISA法檢測血清單核細胞趨化蛋白1(MCP-1，試劑盒購自美國R&D公司)、8-異前列腺素F2α(8-Iso-PGF2α，試劑盒購自美國Cayman公司)、TNF-α(試劑盒購自美國Sigma公司)和轉化生長因子-β1(TGF-β1，試劑盒購自美國R&D公司)水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 血清Klotho mRNA相對表達量 采用實時熒光定量PCR法。參照上法抽取各組晨起空腹靜脈血后制備血清，采用TRIzol總RNA提取試劑盒(購自美國Biomiga公司)對總RNA進行提取，利用紫外分光光度計檢測樣品純度，以A260/A280≥1.80為合格樣品。采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板采用PCR試劑盒進行PCR反應。Klotho基因及內參引物序列均由上海生工生物公司設計合成，Klotho上游引物：5′-ACCTGGTGGCGCACAC-3′，下游引物：5′-TTGGCAAACCAACCTAGTACA-3′；GAPDH上游引物：5′-GACCTGGTGGCGCACAC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應條件：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、45 s，連續進行36個循環，每個樣品均設置3個平行反應復孔。以2-ΔΔCt法計算血清Klotho mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 各組一般資料比較 各組性別、年齡、收縮壓、舒張壓和BMI比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。觀察Ⅱ組和觀察Ⅲ組糖尿病病程均長于觀察Ⅰ組和對照組，且觀察Ⅲ組糖尿病病程更長(P均<0.05)。見表1。

表1 各組一般資料比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與觀察Ⅰ組比較，#P<0.05；與觀察Ⅱ組比較，△P<0.05。

2.2 各組生化相關指標比較 各組HbA1C和TC比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組尿蛋白、ROG逐漸升高，GFR逐漸降低；組間兩兩比較P均<0.05。觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組Scr、BUN均高于對照組，且觀察Ⅲ組升高最明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組生化相關指標比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與觀察Ⅰ組比較，#P<0.05；與觀察Ⅱ組比較，△P<0.05。

2.3 各組血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α水平和Klotho mRNA相對表達量比較 見表3。

表3 各組血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α、TGF-β1水平和Klotho mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與觀察Ⅰ組比較，#P<0.05；與觀察Ⅱ組比較，△P<0.05。

2.4 糖尿病腎病患者血清Klotho mRNA相對表達量與其他指標的關系 Spearman相關分析顯示，糖尿病腎病患者血清Klotho mRNA相對表達量與糖尿病病程、尿蛋白、Scr、ROG及血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α和TGF-β1水平均呈負相關(r分別為-0.624、-0.751、-0.696、-0.708、-0.829、-0.895、-0.924和-0.795，P均<0.05)，與GFR呈正相關(r=0.702，P<0.05)。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者的常見微血管并發癥之一，是導致終末期腎病的最常見原因。主要依靠尿微量白蛋白是目前臨床診斷早期糖尿病腎病的常用指標，但其不能反映腎小球硬化的嚴重程度，同時易受感染、發熱等因素影響。腎組織活檢是腎臟疾病診斷及病情評估的金標準，但具有侵入性，臨床應用受到限制[6]。因此積極尋找一種可反映糖尿病腎病病情嚴重程度的指標對指導治療及改善患者預后具有重要意義。Klotho是一種抗衰老基因，主要表達于腎臟遠曲小管上皮細胞和腦脈絡膜，在調控衰老過程及與衰老相關疾病中發揮重要作用，研究表明，Klotho在氧化應激損傷小鼠髓內集合管細胞中表達下降，而提高Klotho表達具有保護腎臟功能的作用，可作為糖尿病腎病早期診斷的生物標志[7～9]。

本研究顯示，觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清Klotho mRNA相對表達量均低于對照組，且觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組逐漸降低，說明糖尿病腎病患者血清Klotho基因表達下降，且與患者的病理分型有關，病理分型越高，血清Klotho表達越低。Spearman相關分析顯示，糖尿病腎病患者血清Klotho mRNA相對表達量與糖尿病病程、尿蛋白、Scr、ROG均呈負相關，與GFR呈正相關，進一步說明血清Klotho mRNA相對表達量與糖尿病腎病患者的病情嚴重程度有關。

研究表明，炎癥、氧化應激是急、慢性腎病的發病機制之一[10]。MCP-1、8-Iso-PGF2、TNF-α是反映炎癥和氧化應激反應的重要指標[11]。本研究觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α水平均高于對照組，且觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組上述指標依次升高，組間比較均有統計學差異。說明糖尿病腎病患者發生了炎癥、氧化應激反應，且與病理分級有關。Spearman相關分析顯示，糖尿病腎病患者血清Klotho mRNA相對表達量與MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α均呈負相關，提示Klotho可能與抗氧化應激、炎癥反應有關[12]。

TGF-β1是糖尿病腎病發生、進展中重要的細胞因子，可誘導腎小管和腎小球細胞肥大，抑制細胞外基質降解，引發腎間質纖維化[13]；亦參與尿蛋白的形成，與腎小球硬化密切相關[14]。本研究觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組血清TGF-β1水平均高于對照組，且觀察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組上述指標依次升高，說明TGF-β1參與了糖尿病腎病的病理進展過程。Pearson相關分析顯示，糖尿病腎病患者血清Klotho mRNA相對表達量與TGF-β1水平呈負相關，提示Klotho降低可能與其抑制腎間質纖維化及腎小球硬化有關。

綜上所述，糖尿病腎病患者血清Klotho表達降低，且與病情嚴重程度有關，有望成為判斷患者病理嚴重程度的生物學指標。Klotho可能通過抑制氧化應激、炎癥反應及腎間質纖維化而參與糖尿病腎病的發生、發展，但具體作用機制尚待進一步研究。

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高艷青(E-mail: 1564570864@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.029

R587.2

B

1002-266X(2017)04-0085-03

2016-02-03)