二至天癸顆粒對小鼠卵細胞及胚胎質量的影響及其機制

李婷婷，連方，孫振高

(1山東中醫藥大學，濟南 250355;2山東中醫藥大學附屬醫院)

二至天癸顆粒對小鼠卵細胞及胚胎質量的影響及其機制

李婷婷1，連方2，孫振高2

(1山東中醫藥大學，濟南 250355;2山東中醫藥大學附屬醫院)

目的 探討二至天癸顆粒提高小鼠卵細胞及胚胎質量的機制。方法 將180只7周齡雌性小鼠按隨機數字表法分為三組各60例。二至天癸組予二至天癸顆粒加注射用尿促性素(HMG)超排卵；注射用絨毛膜促性素(HCG)組予HMG及HCG超排卵；空白組不干預。每組各30只取卵及顆粒細胞，解剖鏡下觀察卵母細胞形態，有極體排出計為MⅡ卵，計算優質卵率(MⅡ卵/獲卵數)。剩余30只小鼠取胚胎行形態學觀察，記錄優質胚胎數、計算優質胚胎率。Western blotting法和RT-PCR法分別檢測顆粒細胞FasL、Fas、Caspase8、Caspase3 mRNA及其蛋白表達；熒光素酶法檢測MⅡ卵及胚胎ATP。分析FasL、Fas、Caspase8、Caspase3表達與MⅡ卵及胚胎平均ATP的相關性。結果 三組獲卵數和MⅡ卵數比較，結果均為二至天癸組>HCG組>空白組，但二至天癸組與HCG組比較差異無統計學意義(P均>0.05)，兩組與空白組比較差異均有統計學意義(P均<0.01)；三組優質卵率和MⅡ卵平均ATP含量比較，結果均為二至天癸組>空白組>HCG組，且二至天癸組明顯高于HCG組(P<0.05)，但二至天癸組和空白組相比、空白組和HCG組比較差異均無統計學意義(P>均0.05)。三組胚胎數比較，二至天癸組>HCG組>空白組，但HCG組和空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)；優質胚胎數二至天癸組>空白組>HCG組，但三組間兩兩比較均無統計學差異(P均>0.05)；優質胚胎率和胚胎平均ATP空白組與二至天癸組比較無統計學差異(P>0.05)，兩組均明顯高于HCG組(P均<0.01)。二至天癸組Fas和Caspase3蛋白及mRNA表達均低于HCG組(P均<0.05)，與空白組比較無統計學差異(P均>0.05)；FasL蛋白及mRNA三組間表達比較均無統計學差異(P均>0.05)；二至天癸組Caspase8 mRNA與HCG組比較無統計學差異，但Caspase8蛋白表達低于HCG組(P>0.05)。Caspase3蛋白和mRNA的表達與MⅡ卵及胚胎平均ATP含量均呈負相關(P均<0.05)。結論 二至天癸顆粒可提高卵細胞質量和胚胎質量，其機制可能為下調顆粒細胞Fas、Caspase3表達。

二至天癸顆粒；顆粒細胞；Fas通路；小鼠

近幾年輔助生殖技術飛速發展，但臨床妊娠率始終較低，沒有大的突破。2012年9月ESHRE公布歐洲國家體外授精-胚胎移植/卵胞漿內單精子顯微注射技術(IVF/ICSI)成功率僅在30%左右[1]。隨著自然環境和社會環境的變化，影響人類配子和受精卵質量的因素日趨增多而復雜，不孕癥發病率也逐年增高。影響成功妊娠的因素較多，其中卵母細胞質量和胚胎發育潛能是關鍵因素之一。包繞著卵母細胞的顆粒細胞(以下稱顆粒細胞)為卵巢的主要功能細胞之一，具有支持和營養卵母細胞的作用，是影響生殖功能的重要一環。二至天癸顆粒來源于山東中醫藥大學附屬醫院連方教授創立的補腎調沖之二至天癸方。多年來在臨床上用于行IVF-ET的不孕癥患者，臨床及實驗研究發現其能提高卵母細胞和胚胎質量，改善子宮內膜容受性，提高妊娠率。本研究探討二至天癸顆粒提高大鼠卵細胞與胚胎質量的效果及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：同一時期出生的7周齡SPF級健康性成熟昆明種雌性小鼠180只(山東大學醫學院實驗動物中心提供)，體質量(35±5)g。動物質量合格許可證號：SCXK(魯)20140004。適應性飼養1周后對雌鼠行陰道分泌物涂片檢查確定動情周期，見大量卵圓角化細胞即確定為動情期，將連續觀察到兩個動情周期的小鼠納入實驗。實驗藥物：二至天癸顆粒，山東中醫藥大學附屬醫院制劑室提供[院內批號：(01)FZ032-03]，規格：3 g/包，12包/袋；組成：女貞子、旱蓮草、菟絲子、枸杞子、當歸、白芍、川芎、熟地黃、制香附、炙甘草。注射用尿促性素(HMG)、注射用絨毛膜促性素(HCG)均由麗珠集團麗珠制藥廠生產。試劑與儀器：抗體均購自Bioworld公司，引物由上海漢尹生物科技有限公司設計合成，三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒為碧云天生物技術公司產品，編號S0026。

1.2 動物分組及干預 將符合實驗標準的180只雌性小鼠隨機分為二至天癸組、HCG組、空白組，各60只。采用人與動物的體表面積直接計算法[2]計算小鼠的每日用藥量，小鼠每日服用二至天癸顆粒0.1 g相當一般成人的每日服藥量。取一包二至天癸顆粒溶于7.5 mL蒸餾水，得0.4 g/mL混懸液，每日0.25 mL灌胃。注射用HMG 75 U溶于2.5 mL生理鹽水中，每只小鼠每次取0.4 mL注射。注射用HCG 1 000 U溶于2.5 mL生理鹽水中，取0.1 mL(40 U)加0.9 mL生理鹽水，每次注射0.3 mL。每日下午16時雌鼠灌胃給藥，二至天癸組用二至天癸顆粒，HCG組及空白組用等量蒸餾水，均連續10 天。第11天(下午16時)二至天癸組與HCG組同時腹腔注射HMG 10 IU，48 h后腹腔注射HCG 12 IU。

1.3 標本獲取 每組各取半數小鼠，二至天癸組及HCG組于注射HCG后14 h、空白組于陰道上皮角化次日(對雌鼠行陰道分泌物涂片檢查確定動情周期)斷頸處死，剪取輸卵管，收集卵丘復合物及顆粒細胞;選取MⅡ期卵細胞脫顆粒，分離顆粒細胞。每組剩余半數小鼠按照雌∶雄=1∶1提前兩周準備8周齡雄性小鼠適應性飼養，于雌鼠注射HCG后分別合籠飼養，次日晨檢栓，合籠40 h后同上法處死小鼠，解剖取出輸卵管，TB 針沖洗一端，使受精卵從另一端流出，收集受精卵于含P-1液的四孔培養皿中進行形態學觀察后放入培養箱待用。

1.4 相關指標觀察 ①卵細胞、胚胎形態學變化：解剖鏡下觀察卵母細胞形態，有極體排出計為MⅡ卵，分裝每只鼠所獲的MⅡ卵，計算優質卵率(MⅡ卵/獲卵數)。分裝每只鼠所獲胚胎，進行形態學觀察，記錄優質胚胎數、計算優質胚胎率。②顆粒細胞FasL、Fas、Caspase8、Caspase3表達：Western blotting法檢測顆粒細胞FasL、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白的相對表達量；RT-PCR法檢測顆粒細胞FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase8 mRNA、Caspase3 mRNA的相對表達量。③MⅡ卵及胚胎線粒體ATP含量：熒光素酶法檢測MⅡ卵及胚胎線粒體ATP，按照試劑盒說明進行操作。

2 結果

因在動情周期觀察、給藥、標本留取及檢測過程中均有小鼠被剔除，最終計入統計的為每組各40只。

2.1 三組卵及胚胎情況比較 見表1、2。

表1 三組卵基本情況比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01；與HCG組比較，#P<0.01。

表2 三組胚胎基本情況比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01；與HCG組比較，#P<0.01。

2.2 三組FasL、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白表達比較 見表3。

表3 三組FasL、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01；與HCG組比較，#P<0.01。

2.3 三組FasL、Fas、Caspase8、Caspase3 mRNA表達比較 見表4。

表4 三組FasL、Fas、Caspase8、Caspase3 mRNA

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01；與HCG組比較，#P<0.05。

2.4 相關性分析 Caspase3蛋白和mRNA相對表達量與MⅡ卵ATP含量均呈負相關(r分別為-0.326和-0.266，P均<0.05)，與胚胎線粒體ATP含量亦均呈負相關(r分別為-0.398和-0.319，P均<0.05)；FasL、Fas、Caspase8蛋白和mRNA相對表達量與MⅡ卵ATP含量、胚胎線粒體ATP含量均無明顯相關性(P均>0.05)。

3 討論

卵母細胞和胚胎著床以前的發育有賴于能量的產生，線粒體內氧化磷酸化作用產生的ATP可反映卵母細胞和胚胎耗氧量，是整體代謝活性的評判指標。Tejera等[3]測定IVF治療患者的卵母細胞耗氧率發現，能正常受精的卵母細胞較不受精或異常受精者具有更高的耗氧率，形成胚胎并成功著床的卵母細胞亦高于未著床者，提示在受精前單個卵母細胞的耗氧率可作為無創評估卵母細胞質量及其發育潛能的良好指標[4]。線粒體活性與數目較低的卵母細胞往往容易發生成熟障礙，受精失敗以及胚胎發育能力低下[4～7]。本研究結果顯示，MⅡ卵ATP含量二至天癸組>空白組>HCG組，二至天癸組明顯高于HCG組；胚胎數二至天癸組>空白組>HCG組，但空白組和HCG組之間比較無明顯統計學差異；優質胚胎數二至天癸組>空白組>HCG組，且組間比較均具有明顯統計學差異；優質胚胎率和胚胎線粒體ATP含量二至天癸組>空白組>HCG組，但二至天癸組與空白組比較無明顯統計學差異。可見二至天癸顆粒可以提高卵和胚胎的活性，從而提高卵細胞和胚胎質量，以利于受精和胚胎發育。

FasL/Fas-FADD-Caspase8-Caspase3為經典的凋亡通路，可介導多個器官內多種組織細胞凋亡。本研究結果表明，二至天癸組Fas和Caspase3 mRNA及其蛋白表達均明顯低于HCG組，與空白組比較無統計學差異；FasL mRNA及其蛋白表達三組間比較均無統計學差異；二至天癸組Caspase8 mRNA表達與HCG組比較無統計學差異，但Caspase8蛋白表達明顯低于HCG組。四個關鍵蛋白和mRNA的表達在三組的表達大致趨勢是一致的，二至天癸組的表達低于HCG組，與空白組的表達水平大致相當。其組內的表達差異一是考慮個體差異，二是在信號轉導的復雜通路中，蛋白可能受到上游下游多個蛋白的共同調控。說明某一蛋白表達上調或下調只能從一個側面反映機體狀況或藥物作用，如需深入研究則應構建整個信號轉導網絡。這與中醫整體觀念的思路是一致的。

Caspase3是一種細胞內蛋白酶家族，在哺乳動物細胞的凋亡過程中起關鍵作用。目前己經發現了14種不同的Caspase分子，其中Caspase3是最為重要的最終效應Caspase分子[8]。在正常情況下體內的Caspase3蛋白酶以未活化的形式，即酶原形式存在[9,10]。Caspase3活化涉及到一系列上游Caspase級聯反應，并受到多種細胞內小分子的調控，如凋亡抑制蛋白、Bcl-2家族蛋白、鈣蛋白酶等。只有在上游Caspase作用下，Caspase3大、小亞基之間天冬氨酸殘基發生水解，使兩者的位置發生交換，形成異源四聚體的活化形式，才能執行細胞凋亡的發生[11～14]。本研究二至天癸組顆粒細胞Caspase3蛋白表達明顯低于HCG組；顆粒細胞Caspase3表達與MⅡ卵和胚胎線粒體ATP含量具有相關性。推測Caspase3可能為最終效應分子，與卵細胞和胚胎質量的相關性關系密切。綜上所述，二至天癸顆粒可提高卵細胞和胚胎質量。其機制可能與下調顆粒細胞Fas通路Fas、Caspase3表達有關。顆粒細胞Caspase3表達作為卵細胞質量評估和胚胎選擇的客觀指標之一。

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國家自然科學基金資助項目(81473720)。

連方(E-mail： f_lian@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.011

R321.1

A

1002-266X(2017)04-0037-03

2016-03-20)