大麻二酚對急性腦出血小鼠的神經保護作用及其機制

高兵兵，吳月奎，馬建華，易波，戴宜武

(安徽醫科大學北京軍區總醫院，北京100700)

大麻二酚對急性腦出血小鼠的神經保護作用及其機制

高兵兵，吳月奎，馬建華，易波，戴宜武

(安徽醫科大學北京軍區總醫院，北京100700)

目的 探討大麻二酚對急性腦出血小鼠的神經保護作用及其機制。方法 將72只C57BL/6小鼠隨機分為假手術組、模型組和大麻二酚組，每組24只。模型組和大麻二酚組采用Ⅶ型膠原酶注入紋狀體的方法制備急性腦出血模型，假手術組注入等量生理鹽水。大麻二酚組術后2、12、24、48 h腹腔注射大麻二酚20 mg/kg。術后2、72 h采用神經行為學評分評價各組神經功能；術后72 h檢測腦組織含水量，采用ELISA法檢測腦組織IL-1β、IL-6表達，TUNEL染色后計數神經細胞凋亡數量。結果 模型組、大麻二酚組和假手術組術后2、72 h神經行為學評分均依次降低，兩兩比較P均<0.05。模型組、大麻二酚組和假手術組腦組織含水量、神經細胞凋亡數量和腦組織IL-1β、IL-6表達均依次降低，兩兩比較P均<0.05。結論 大麻二酚對急性腦出血小鼠具有神經保護作用；抑制IL-1β、IL-6表達可能為其作用機制。

急性腦出血；大麻二酚；腦水腫；炎癥；神經細胞凋亡；小鼠

腦出血是一種急性腦卒中，患者多合并嚴重的神經損傷[1，2]。研究表明，繼發性腦水腫、神經炎癥反應和神經元凋亡均可造成腦出血患者的神經損傷[3，4]。大麻二酚提取于天然植物大麻，無精神效應，對焦慮、抑郁、驚厥和腫瘤等均具有治療作用[5]。但目前關于大麻二酚對腦出血后神經損傷的治療作用鮮見報道。2015年5～12月，我們觀察了大麻二酚對急性腦出血小鼠的神經保護作用，現分析結果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性C57BL/6小鼠72只，10周齡，體質量20～25 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。主要試劑及儀器：大麻二酚溶液購于上海源葉生物科技有限公司，Ⅶ型膠原酶購于美國Sigma公司，ELISA試劑盒購于美國Minneapolis公司，TUNEL試劑盒購于德國Roche公司；立體定向儀購于美國Stoelting公司。

1.2 急性腦出血模型制備 將72只小鼠隨機分為大麻二酚組、模型組和假手術組各24只。大麻二酚組及模型組制備腦出血模型：3.6%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射麻醉，小鼠固定于立體定向儀。剪開頭皮，充分暴露前囟，以前囟為原點定位鉆孔(右1.8 mm、前0.8 mm、硬膜下3.0 mm)，將150 mL膠原酶生理鹽水混合液(含0.05 U Ⅶ型膠原酶)注入紋狀體，停針10 min后緩慢拔針，縫合頭皮；假手術組注入150 mL生理鹽水，其余處理同大麻二酚組、模型組。各組術后2 h通過Grid Test行神經行為學評分， 0分為運動功能正常；1分為提起尾部后小鼠雙側前肢和軀干屈曲；2分為小鼠向腦出血側旋轉，但休息時姿勢正常；3分為小鼠向腦出血側旋轉，休息時向腦出血側依靠；4分小鼠為向腦出血側滾動；5分為小鼠休息時向腦出血側依靠(無自主活動)。結果顯示，大麻二酚組、模型組神經行為學評分均為(5.0±0.0)分，均明顯高于假手術組0分(P均<0.05)；證實急性腦出血模型制備成功。

1.3 分組處理 三組分別于術后2、12、24、48 h腹腔注射0.5 mL/20 g混合液(2%吐溫80+生理鹽水)，大麻二酚組同時腹腔注射20 mg/kg大麻二酚(0.4 mg/0.5 mL)。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 神經行為學評分 各組術后72 h隨機選取16只小鼠，參照1.2的方法行神經行為學評分，以評價神經功能。

1.4.2 腦組織含水量 各組術后72 h隨機選擇8只處死，迅速取出大腦，分離出血側腦組織。稱量大腦濕重，將其在100 ℃烘箱中持續烘干24 h，稱量大腦干重。腦組織含水量=(大腦濕重-大腦干重)/大腦濕重×100%。

1.4.3 腦組織IL-1β、IL-6表達 采用ELISA法。各組術后72 h另取8只處死，迅速取出大腦，分離出血側腦組織，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA試劑盒檢測腦組織IL-1β、IL-6表達，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.4 神經細胞凋亡情況 采用TUNEL染色。各組均于術后72 h取剩余8只小鼠固定好的腦組織，采用15%和30% PBS蔗糖溶液進行梯度脫水，15 μm厚度切片。4 ℃條件下，將腦組織切片在含0.1%Triton X-100、0.1%檸檬酸鈉的PBS溶液中孵育2 min，PBS溶液沖洗3次，每次5 min；每個切片上加50 μL TUNEL反應混合液(TdT/熒光素標記的dUTP=1/9)，37 ℃條件下暗濕盒中反應1 h，PBS洗3次；加入50 μL converter-POD，37 ℃條件下暗濕盒中反應1 h，PBS洗3次。加入50 μL DAB底物，室溫下反應10 min，PBS漂洗3次，最后進行蘇木素染色。200倍光學顯微鏡下隨機選取4個視野，計數凋亡細胞數量，取平均值。凋亡細胞核染色呈棕色，正常細胞核染色呈藍色。

2 結果

2.1 各組神經行為學評分 模型組術后72 h神經行為學評分為(3.4±0.5)分，大麻二酚組為(1.9±0.6)分，假手術組為0分；三組神經行為學評分依次降低，兩兩比較P均<0.05。

2.2 各組腦組織含水量比較 模型組術后72 h腦組織含水量為81.65%±0.39%，大麻二酚組為79.50%±0.08%，假手術組為78.91%±0.12%；三組腦組織含水量依次降低，兩兩比較P均<0.05。

2.3 各組腦組織IL-1β、IL-6表達比較 模型組、大麻二酚組和假手術組腦組織IL-1β、IL-6表達均依次降低，兩兩比較P均<0.05。見表1。

表1 各組腦組織IL-1β、IL-6表達比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與大麻二酚組比較，#P<0.05。

2.4 各組神經細胞凋亡數量比較 術后72 h模型組神經細胞凋亡數量為(119.4±8.2)個，大麻二酚組為(73.4±4.9)個，假手術組為(17.0±3.7)個；三組神經細胞凋亡數量依次降低，兩兩比較P均<0.05。

2.5 神經細胞凋亡數量與其他指標的關系 Spearman相關分析顯示，小鼠神經細胞凋亡數量與神經行為學評分、腦組織含水量、腦組織IL-1β表達、腦組織IL-6表達均呈正相關(r分別為0.512、0.525、0.379、0.370，P均<0.05)。

3 討論

腦水腫是腦出血后的繼發性損傷之一，可導致顱內壓增高、腦組織損傷、腦疝等，從而危及患者生命[3,6]。腦水腫經典的發生機制為血管源性水腫和細胞毒性水腫，腦出血后的一系列病理變化，包括靜水壓改變和血凝塊回縮等導致血清蛋白滲入到周圍組織中，激活凝血系統并產生凝血酶，促進炎癥因子表達并破壞血腦屏障，進而導致血管源性水腫；隨后紅細胞裂解釋放出血紅蛋白，介導細胞毒性[2,6～8]。本研究結果顯示，模型組、大麻二酚組和假手術組腦組織含水量依次降低，組間兩兩比較有統計學差異；說明大麻二酚能減輕急性腦出血小鼠的腦水腫，但是其具體機制尚不明確。

在急性腦出血過程中，小膠質細胞、星型膠質細胞、神經元和內膜細胞等均可分泌炎癥介質，如IL-1、IL-6等，這些炎癥介質刺激細胞黏附因子表達，從而促進白細胞黏附、遷移到腦實質中，參與腦損傷[9～12]。本研究結模型組、大麻二酚組和假手術組腦組織IL-1和IL-6表達依次降低，組間兩兩比較有統計學差異；說明大麻二酚能抑制炎癥因子的表達，進而抑制炎癥反應；其機制可能與大麻二酚抑制星型膠質細胞和小膠質細胞的激活和聚集，從而抑制炎癥介質的釋放有關[12，13]，仍需進一步研究。

研究證實，腦出血所導致的細胞凋亡主要存在于血腫周圍，遠離血腫區域并無明顯的細胞凋亡[14]。炎癥反應可導致神經細胞凋亡，包括神經元、星型膠質細胞和內膜細胞等，凋亡細胞可激活小膠質細胞和星型膠質細胞，并促進其聚集，釋放炎癥介質，加重炎癥反應[14～16]。本研究模型組、大麻二酚組和假手術組神經行為學評分和神經細胞凋亡數量均依次降低，組間兩兩比較有統計學差異，且神經行為學評分和神經細胞凋亡數量呈正相關；說明大麻二酚具有抑制神經細胞凋亡，保護神經功能的作用。

綜上所述，大麻二酚對急性腦出血小鼠具有神經保護作用；其機制可能與抑制IL-1、IL-6表達有關。

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國家自然科學基金資助項目(81271391)。

戴宜武(E-mail: daiyiwuu@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.010

R743.34

A

1002-266X(2017)04-0034-03

2016-01-14)