大鼠下丘神經元鈣蛋白酶1表達與水楊酸鈉所致聽力損害的關系

黃志輝，黃逸慧，陳慧英，韋廷佳，蘇紀平，黃瑋

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

·基礎研究·

大鼠下丘神經元鈣蛋白酶1表達與水楊酸鈉所致聽力損害的關系

黃志輝，黃逸慧，陳慧英，韋廷佳，蘇紀平，黃瑋

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

目的 探討下丘神經元鈣蛋白酶1表達與水楊酸鈉所致聽力損害發生的關系。方法 將36只健康SD大鼠隨機分為水楊酸鈉組及對照組，每組18只。水楊酸鈉組腹腔注射水楊酸鈉350 mg/kg(50 mg/mL)，對照組腹腔注射等量生理鹽水，均連續注射28天。分別于注射前1天、注射1周及注射4周行聽性腦干反應測量兩組聽力閾值，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潛伏期以及Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期。采用免疫組織化學法檢測兩組下丘神經元鈣蛋白酶1表達。結果 與對照組比較，水楊酸鈉組聽力閾值增大，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潛伏期及Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期延長；下丘神經元鈣蛋白酶1相對表達量增加(P均<0.01)；隨用藥時間延長上述指標變化更為明顯(P均<0.05)。結論 鈣蛋白酶1參與了水楊酸鈉導致聽力損傷的過程；鈣蛋白酶1在下丘神經元表達量可反映聽力損傷程度。

聽力損傷；水楊酸鈉；下丘神經元；鈣蛋白酶1；大鼠

水楊酸鈉是解熱鎮痛藥阿司匹林的活性成分，臨床應用廣泛。但其在臨床使用過程中常導致耳聾、耳鳴、聽力下降。已有研究表明，水楊酸鹽可透過血腦屏障，對聽覺系統各個部位有直接作用[1,2]，其作用于毛細胞到聽皮層等聽覺通路各個環節影響聽力。下丘是聽覺傳導中樞的中繼站，在聲音頻率、強度、時間因素及聲源定位的分析中均起重要作用，亦是水楊酸鹽藥物作用的靶點之一。鈣蛋白酶(Calpain)是一種細胞內鈣依賴的半胱氨酸蛋白水解酶，其中μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶在中樞神經系統廣泛存在，參與細胞凋亡、基因表達調控以及多種神經退行性病變等過程。μ-鈣蛋白酶較m-鈣蛋白酶可在更低濃度Ca2+條件下激活，鈣蛋白酶1(Calpain 1)為μ-鈣蛋白酶大亞基，是μ-鈣蛋白酶激活后主要活性成分。本研究探討鈣蛋白酶在水楊酸鈉所致聽力損傷發生中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，雌雄不限，體質量200～250 g，聽性腦干反應(ABR)測量聽力閾值≥40 dB SPL。

1.2 動物分組及處理 選取符合條件的36只健康大鼠，在廣西醫科大學動物中心SPF級實驗動物房適應性飼養1周；將大鼠隨機分為水楊酸鈉組和對照組，各18只。水楊酸鈉組每天腹腔注射水楊酸鈉(水楊酸鈉用生理鹽水配制，濃度為50 mg/mL，按350 mg/kg腹腔注射)，對照組腹腔注射等量生理鹽水；共4周。

1.3 ABR檢測 兩組分別于水楊酸鈉注射前1天、注射1周和注射4周時行ABR檢測：采用美國產Bio-logic多功能電生理儀。檢測前用1%戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注射麻醉，15 min后將大鼠固定在固定架上，接上電極。刺激聲采用roaring click短促音，脈沖寬度0.1 ms，掃描時程10 ms，刺激率為30～50次/s，刺激強度由100 dB SPL到10 dB SPL，以5 dB SPL梯度遞減，揚聲器距離大鼠測試耳外耳門約1 cm處固定，采集波濾波范圍設定為300～3 000 Hz，疊加512次，實驗數據記錄時以Ⅲ波剛消失時刺激強度作為聽力閾值。測量各時期Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潛伏期，Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期。

1.4 下丘神經元Calpain 1表達檢測 采用免疫組化法。ABR檢測完成后采用4%多聚甲醛對大鼠心臟灌注固定，取出下丘，固定48 h脫水透明，石蠟包埋。石蠟切片厚度為4 μm，每張切片脫蠟后用3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性10 min，PBS沖洗后用枸櫞酸鈉緩沖液高壓修復10 min，PBS沖洗，滴加5%BSA封閉15 min，一抗4 ℃過夜后二抗孵育10 min。用新鮮配置的DAB溶液顯微鏡下顯色2～10 min，蘇木素復染，自來水返藍后脫水透明，以中性樹脂封片。玻片顯微鏡照相后用Image-Pro Plus軟件對圖像進行分析，以陽性細胞染色(細胞質呈棕黃色)的平均積分光密度值(總IOD/總面積)表示抗原的相對表達量。Calpain 1單克隆抗體購于ORIGENE公司，SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

2 結果

2.1 兩組聽力閾值比較 對照組在注射前1天、注射1周、注射4周不同階段聽力閾值比較差異無統計學意義(F=0.500，P>0.05)；水楊酸鈉組不同階段測聽力閾值比較差異有統計學意義(F=106.215，P<0.01)，且不同時點聽力閾值兩兩比較P均<0.01。注射1周、注射4周水楊酸鈉組聽力閾值均明顯高于對照組(P均<0.01)。見表1。

表1 兩組聽力閾值比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組不同時期ABR檢測各波潛伏期、波間潛伏期比較 見表2。

表2 兩組各波潛伏期、波間潛伏期比較±s)

注：與注射前1天比較，*P<0.05，#P<0.01；與注射1周比較，△P<0.05。

2.3 兩組下丘神經元Calpain 1表達比較 對照組在實驗不同時期，Calpain 1陽性染色的神經元較少，且染色程度相仿。水楊酸鈉組注射前1天陽性染色神經元細胞較少，且染色較淺；注射1周時陽性染色神經元明顯增多，染色較注射前1天有所加深；注射4周可見神經元染色較前兩者顯著的加深；見插頁Ⅰ圖4。兩組注射前1天、注射1周及注射4周Calpain 1相對表達量比較見表3。

表3 兩組下丘神經元Calpain 1相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與同組注射前1天比較，△P<0.01；與同組注射1周比較，#P<0.01。

3 討論

水楊酸鈉不僅對外周的耳蝸具有毒性，亦可透過血腦屏障，直接作用于中樞神經系統抑制耳蝸神經信號的傳導，還可顯著增大下丘、內側膝狀體、大腦皮層等多個部位對聲音信號的反應[1]。研究發現，人應用高濃度水楊酸鹽后不久即會出現短期耳鳴和聽力損害，水楊酸鹽通過加強螺旋神經元(SGN)上的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的電流而增強NMDA受體介導的神經沖動；采用NMDA受體阻滯劑美金剛可顯著降低水楊酸鈉的耳毒性[3]，提示水楊酸鈉耳毒性可能與NMDA受體有關，且NMDA受體激活可促進水楊酸鈉對SGN的神經毒性，NMDA受體阻滯劑可抑制水楊酸鈉神經毒性。此外，水楊酸鈉耳毒性是可逆的，短期應用者停藥可恢復正常，但長期注射水楊酸鈉會永久減少鼠的耳蝸聽神經復合動作電位(CAP)和ABR的振幅[2]，可見除NMDA受體以外，水楊酸鈉對神經不可逆聽力損傷還包含其他損傷通路，導致耳蝸神經元不可逆損傷。

鈣蛋白酶是谷氨酸能突觸傳遞的一個下游靶蛋白，主要表達在神經元胞質和突觸終端[4～7]。當NMDA受體被激活時，鈣離子進入細胞內，可激活鈣蛋白酶。鈣蛋白酶在細胞凋亡過程中起著關鍵作用[8]，可通過對Bax蛋白剪切生成促凋亡片段[9]及激活caspase-3和caspase-12等通路參與細胞凋亡途徑[10]。鈣蛋白酶的激活還參與多種神經退行性病變，如阿爾茨海默病[11]、亨廷頓病[12]等，皆存在鈣離子代謝失調以及鈣蛋白酶活性異常，最終引起神經元凋亡，在退行性病變中起關鍵作用。以上研究均說明病理情況下神經元鈣離子濃度異常、鈣蛋白酶過度激活是導致神經系統功能異常的機制之一。水楊酸鈉長期使用引起的聽力損害作用機制迄今為止還未明確，有相關報道指出水楊酸鈉可增強SGN的NMDA受體電流[13]，并且激活NMDA受體，使神經元內鈣離子和花生四烯酸依賴性超氧化物水平增高[14，15]，最終導致螺旋神經節細胞損傷及凋亡。

本研究結果顯示，水楊酸鈉組注射水楊酸鈉過程中，聽力閾值明顯高于對照組。Liu等[16]對注射水楊酸的大鼠行ABR檢測，發現大鼠在多次注射水楊酸鈉的情況下，各波波幅下降，且隨著注射時間的延長，其ABR反應閾不斷上升，各波潛伏期不斷延長，本研究結果與其相符。此外從水楊酸鈉組Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潛伏期變化情況發現，注射水楊酸鈉1周時，Ⅰ、Ⅲ潛伏期未發生明顯改變，但Ⅴ波明顯升高。Ⅴ波主要反映聽覺傳導中樞下丘電流，推測可能水楊酸鈉可能對下丘神經元影響較早且較明顯。分析Ⅰ～Ⅲ波間潛伏期結果可發現持續水楊酸鈉作用對大鼠聽力損害程度隨時間延長而增大，但Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期測的結果卻并非如此，水楊酸鈉注射1周時Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期明顯更長，注射4周時與注射1周比較差異無統計學意義。該結果產生的原因可能由于NMDA受體本身也是Calpain底物[17]，在水楊酸鈉促進NMDA受體表達的同時，也被Calpain水解，從而減輕Calpain對神經細胞的損害。本研究結果顯示，隨著水楊酸鈉應用時間的延長，大鼠聽力損害逐漸加重，下丘神經元內Calpain 1表達量隨之增加，推測聽力損害的嚴重程度可能與神經元內Calpain 1表達呈正相關。Calpain 1是μ-鈣蛋白酶大亞基，當鈣離子濃度達3～50 μmol/L激活Calpain，水楊酸鈉可促進下丘谷氨酸表達增高，并激活NMDA受體，引起鈣離子濃度失調最終激活Calpain，損傷神經元。

總之，Calpain 1參與了水楊酸鈉導致聽力損傷的過程；Calpain 1在下丘神經元表達量可反映聽力損傷的程度。

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黃瑋(E-mail: 13977166636@139.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.008

R651.1

A

1002-266X(2017)04-0029-03

2016-02-29)