克唑替尼耐藥細胞H2228/CR對紫杉醇及順鉑的敏感性變化及機制

高海祥

(河北省人民醫院，石家莊 050000)

克唑替尼耐藥細胞H2228/CR對紫杉醇及順鉑的敏感性變化及機制

高海祥

(河北省人民醫院，石家莊 050000)

目的 觀察肺腺癌細胞H2228克唑替尼耐藥前后對化療藥物紫杉醇和順鉑敏感性變化，并探討其可能機制。方法 采用克唑替尼體外低濃度梯度遞增聯合大劑量間斷沖擊方法處理H2228細胞，培養克唑替尼耐藥細胞株H2228/CR。MTT法檢測克唑替尼、紫杉醇及順鉑對H2228及H2228/CR細胞的增殖抑制率；實時熒光定量PCR法和Western blotting法分別檢測H2228及H2228/CR細胞波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白的mRNA和蛋白表達。結果 經過6個月的培養，H2228/CR對克唑替尼明顯耐藥，且對紫杉醇及順鉑的敏感性降低。H2228/CR細胞E-鈣黏蛋白mRNA及蛋白表達水平較親代H2228細胞明顯降低，而N-鈣黏蛋白、波形蛋白的mRNA及蛋白表達水平較H2228細胞明顯增高。結論 克唑替尼耐藥細胞H2228/CR對常規化療藥物紫杉醇、順鉑敏感性降低，其耐藥機制可能與H2228/CR細胞發生上皮間質轉化有關。

非小細胞肺癌；耐藥；克唑替尼；紫杉醇；順鉑

克唑替尼為美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)和歐洲腫瘤醫學會(ESMO)推薦的治療間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因陽性非小細胞肺癌的首選藥物[1～7]。但治療過程中耐藥的發生率高[4]。目前肺癌化療后應用克唑替尼的報道較多，但克唑替尼耐藥者對常規化療藥物敏感性的報道鮮見。本研究探討耐克唑替尼的肺腺癌細胞對紫杉醇和順鉑的敏感性及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：H2228細胞系(EML4-ALK融合基因陽性肺腺癌細胞)購于ATCC公司；藥物及試劑：ALK抑制劑克唑替尼購自美國Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培養基、FBS、胰蛋白酶替代物以及MTT檢測試劑購自于美國Gibco公司；鼠抗人波形蛋白單克隆抗、鼠抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗、鼠抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗購自美國Abcam公司；HRP標記抗鼠和兔的二抗、逆轉錄試劑盒、蛋白Marker購自美國Fementas公司。

1.2 H2228耐藥細胞株建立 將解凍的肺腺癌H2228細胞株移至離心管中，添加完全培養液，吹打混勻，離心、去上清液，RPMI 1640培養基中加10%的FBS培養液重懸細胞，調整至合適的細胞密度并接種培養瓶中，放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，次日更換一次培養液，PBS緩沖液清洗，0.25%胰蛋白酶消化傳代。 采用體外低濃度梯度遞增聯合大劑量間斷沖擊方法。根據克唑替尼對細胞半數致死濃度(IC50)，取其約80%濃度(80 nmol/L)起始作用H2228細胞，24 h后換液，PBS沖洗，胰酶消化細胞，根據細胞生長情況選擇傳代周期，持續低濃度誘導，液體每3天更換1次，并取相同濃度的克唑替尼在換液時繼續加入，持續培養，待細胞生長穩定后，增加藥物篩選濃度至160 nmol/L，以此類推，經過6個月的誘導培養，克唑替尼最終濃度增加至800 nmol/L時部分細胞形態由橢圓形變為紡錘形，細胞排列較松散；采用在該濃度克唑替尼中生長良好的細胞作為本次實驗的耐藥細胞株，命名為H2228/CR。

1.3 不同濃度克唑替尼、紫杉醇及順鉑對細胞增殖影響的觀察 采用MTT法。收集對數生長期H2228及H2228/CR細胞，胰酶消化懸浮并計數，培養液稀釋細胞懸液，接種到96孔板，每孔體積200 μL，每組細胞均設置空白調零孔(不含細胞的完全培養基)。于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。取出96孔板，吸去舊培養基，PBS液洗滌2次。采用0、12.5、25、50、100、200 nmol/L的克唑替尼干預H2228，采用0、800、1 600、2 000、4 000、8 000 nmol/L的克唑替尼干預H2228/CR；采用0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L的紫杉醇干預H2228及H2228/CR細胞；采用0、25、50、100、200、400 nmol/L的順鉑干預H2228及H2228/CR細胞，原條件培養44 h。取出孔板，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續孵育4 h，終止培養，每孔加150 μL DMSO，脫色搖床低速震蕩10 min，溶解結晶物。采用酶聯免疫監測儀檢測各孔490 nm波長吸光度值(OD490)；計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=1-(實驗組OD490值-空白調零組OD490值)/(陰性對照組OD490值-空白調零組OD490值)×100%。

1.4 細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室法。將Transwell小室置入無菌的24孔培養板中。將H2228及H2228/CR細胞分別用胰酶消化，用含0.1%血清的MCCOY′S 5A培養基懸浮，計數，稀釋至密度為1×106/mL，每個上室中分別加入200 μL細胞懸液。24孔板下室中均加入600 μL含有30%新生牛血清的MCCOY′S 5A培養基。37 ℃，5%CO2培養箱中繼續培養48 h后棄去孔中培養液，PBS清洗2遍，用4 ℃甲醛500 μL/孔加入下室進行固定30 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，再用0.1%甲紫500 μL染色20 min，用清水洗3遍以上。用200倍顯微鏡下隨機5個視野觀察細胞，計數并采集圖像。

1.5 細胞波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。TRIzol法提取H2228及H2228/CR的總RNA，并將mRNA反轉錄為cDNA，參照公司的Realtime說明進行PCR擴增，反應程序為Stage1：預變性95 ℃ 2 min，熱循環Stage2：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，進行40個循環。擴增完畢后，以GAPDH為內參照基因，目的基因與內參相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)。

1.6 細胞波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白表達檢測 采用Western blotting法。應用含有蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解H2228及H2228/CR，低溫離心機離心，提取上清即為總蛋白；采用BCA法測定蛋白質濃度；100 ℃水浴變性，按次序上樣至電泳道，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳并轉印到PVDF膜上，將膜在含有一抗抗體封閉稀釋液中，4 ℃靜置孵育過夜。TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液，室溫下反應1～2 h或4 ℃反應過夜，再次TBST洗膜，增強化學發光法使蛋白條帶發光并在X光片上曝光顯影。

2 結果

2.1 不同濃度克唑替尼對H2228及H2228/CR細胞的抑制率 經過6個月的培養，H2228細胞可在800 nmol/L濃度的克唑替尼藥物中生長，且細胞形態由橢圓形變為紡錘形，細胞排列較松散。12.5、25、50、100、200 nmol/L克唑替尼對H2228細胞的抑制率分別為(8.34±0.067)%、(21.27±0.060)%、(39.98±0.040)%、(53.89±0.041)%、(68.20±0.012)%；800、1 600、2 000、4 000、8 000 nmol/L克唑替尼對H2228/CR細胞的抑制率分別為(5.28±0.038)%、(19.28±0.054)%、(50.95±0.035)%、(76.26±0.024)%、(81.65±0.044)%；克唑替尼對H2228/CR細胞的抑制作用明顯減弱，IC50從121.9 nmol/L升至2 618.45 nmol/L，即耐藥增加了21.5倍。

2.2 不同濃度紫杉醇和順鉑對H2228及H2228/CR細胞的抑制率 紫杉醇及順鉑對H2228細胞的抑制作用呈濃度依賴性，IC50分別為16.71、60.36 nmol/L，對H2228/CR細胞株的抑制作用減弱，IC50分別為38.6、264.44 nmol/L。詳見表1、2。

表1 不同濃度紫杉醇對H2228及H2228/CR細胞的抑制率

表2 不同濃度順鉑對H2228及H2228/CR細胞的抑制率

2.3 H2228及H2228/CR細胞遷移情況 H2228及H2228/CR細胞分別遷移(80.80±17.87)、(130.4±29.82)個，二者比較P<0.01；見插頁Ⅰ圖3。

2.4 H2228及H2228/CR細胞波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白mRNA表達 H2228/CR細胞N-鈣黏蛋白、波形蛋白mRNA表達明顯高于，E鈣黏蛋白表達明顯低于H2228細胞(P<0.05或<0.01)。見表3。

表3 H2228及H2228/CR細胞波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白mRNA表達比較(RQ值)

2.5 H2228及H2228/CR細胞波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白蛋白表達 H2228/CR細胞波形蛋白、N-鈣黏蛋白表達明顯高于，E-鈣黏蛋白明顯低于H2228細胞(P均<0.05)。見圖1。

圖1 H2228及H2228/CR細胞波形蛋白、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白表達

3 討論

腫瘤細胞耐藥是肺癌治療失敗最常見的原因[9]。本研究結果顯示， H2228/CR對紫杉醇及順鉑出現不同程度的耐藥。進一步分析其耐藥可能與耐藥細胞株H2228/CR的細胞之間結構松散，且由橢圓形向梭形改變，細胞遷移及侵襲性增強有關，說明H2228/CR細胞可能出現了上皮間質轉化(EMT)。EMT是指上皮細胞在特定的生理或病理情況下向間質細胞轉化的現象，上皮細胞表型缺失及間質特性的獲得是其主要特征。波形蛋白、N-鈣黏蛋白是間質細胞的特征性分子學標記物，E-鈣黏蛋白是上皮細胞的特征性分子學標記物， 通過調節這些分子標記物可誘發細胞發生上皮及間質之間的相互轉化[10]。目前多項研究發現，肺癌細胞對多種抗腫瘤藥物的耐藥與肺癌細胞發生EMT相關[11～13]。本研究結果顯示， H2228/CR細胞E-鈣黏蛋白mRNA及其蛋白表達均明顯低于H2228細胞，而N-鈣黏蛋白、波形蛋白mRNA及其蛋白表達均明顯高于H2228細胞，進一步從分子水平證實了耐藥細胞發生了EMT。Kim等[12]研究發現，耐克唑替尼細胞發生了EMT；而應用siRNA抑制波形蛋白表達并逆轉EMT后，耐藥細胞部分恢復了對克唑替尼的敏感性。本研究H2228/CR細胞對常規化療藥物紫杉醇、順鉑均出現不同程度的耐藥，與之前報道的相似；應用miR-200c轉染耐克唑替尼細胞后發現，耐藥細胞亦出現了EMT相反的過程，同時耐藥程度減低。

綜上所述，EMT是H2228細胞發生對克唑替尼、紫杉醇及順鉑耐藥的原因，發生EMT的細胞其耐藥是廣泛的，包括對化療藥物及分子靶向藥物的耐藥。臨床上ALK陽性肺癌患者首選分子靶向藥物為克唑替尼，但后期可能出現肺癌細胞EMT從而對克唑替尼耐藥并出現對紫杉醇和順鉑的交叉耐藥，如果該患者再次接受包含以上化療藥物的治療則受益程度會受到限制。今后的研究將針對延緩或逆轉肺癌細胞EMT的發生進而延緩腫瘤細胞耐藥的發生。

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Changes of chemosensitivity of crizotinib-resistant cells H2228/CR to paclitaxel and cisplatin

GAOHaixiang

(HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050000,China)

Objective To observe the sensitivity changes of lung adenocarcinoma H2228 cells to paclitaxel and cisplatin before and after resistance to crizotinib, and to explore the molecular mechanism. Methods Crizotinib-resistant H2228/CR cells were induced by continuous stepwise exposure to crizotinib combined with pulse therapy in vitro. MTT assay was used to measure the growth inhibition ratio of H2228 and H2228/CR cells treated with different concentrations of crizotinib, paclitaxel and cis-platinum. Real-time fluorescence quantification PCR and Western blotting were used to measure the mRNA and protein expression of Vimentin, N-cadherin and E-cadherin in H2228 and H2228/CR cells. Results After being cultured for 6 months, H2228/CR cell displayed significantly resistance to crizotinib and its resistance to paclitaxel and cisplatin was decreased. The mRNA and protein expression of E-cadherin was decreased in H2228/CR cells as compared with that of the parental cell line H2228, while the mRNA and protein expression of N-cadherin and Vimentin was increased in H2228/CR cells. Conclusion The crizotinib-resistant H2228/CR cells decrease sensitivity to standard chemotherapeutic drugs paclitaxel and cisplatin, which may be associated with the epithelial-mesenchymal transition of H2228/CR cells.

non-small-cell lung cancer; drug resistance; crizotinib; paclitaxel; cisplatin

河北省醫學科學研究重點課題計劃(20160065)。

高海祥(1979-)，男，博士，主治醫師，研究方向為呼吸系統腫瘤、呼吸系統感染性疾病。E-mail： gaohaixiang0801@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.005

R979.1

A

1002-266X(2017)04-0025-04

2016-03-18)