乳腺癌干細胞BLM、RecQ4蛋白表達變化及意義

魯媛，葛章文，劉杰麟

(貴州醫科大學，貴陽550004)

乳腺癌干細胞BLM、RecQ4蛋白表達變化及意義

魯媛，葛章文，劉杰麟

(貴州醫科大學，貴陽550004)

目的 探討乳腺癌干細胞BLM、RecQ4蛋白表達變化及其臨床意義。方法 采用無血清培養法從乳腺癌MDA-MB-435細胞中分離乳腺癌干細胞(以下稱干細胞)，并鑒定。觀察MDA-MB-435細胞裸鼠及干細胞成瘤能力，RT-PCR法檢測二者ATP結合盒膜轉運蛋白G2(ABCG2)mRNA相對表達量，Western blotting法和免疫組化法檢測二者BLM、RecQ4蛋白表達。結果 干細胞膜表面CD44+CD24-/low比例明顯高于、CD44+CD24+比例明顯低于MDA-MA-435細胞(P均<0.05)；兩種細胞膜表面CD44-CD24+、CD44-CD24-比例比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。裸鼠成瘤實驗結果顯示，與接種相同密度MDA-MB-435細胞比較，接種干細胞的裸鼠成瘤時間早、腫瘤體積大；干細胞ABCG2 mRNA相對表達量為0.753±0.025，MDA-MB-435細胞為0.563±0.112；兩者比較P<0.05。干細胞BLM蛋白表達低、RecQ4蛋白表達高于MDA-MB-435細胞(P均<0.05)。結論 乳腺癌干細胞成瘤能力強；細胞BLM蛋白表達降低、RecQ4蛋白表達升高可能為其機制。

乳腺癌；無血清培養；乳腺癌干細胞；RecQ家族解旋酶

腫瘤干細胞學說認為乳腺癌干細胞是乳腺癌發生、發展的根源[1,2]。RecQ解旋酶是一種DNA解旋酶，人體中存在RecQL、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5五種RecQ解旋酶，BLM、RecQ4突變將會導致相應疾病的發生，患者存在基因型不穩定和癌癥易患性等共同特征[3]。2013年9月～2015年7月，本研究觀察了乳腺癌干細胞(以下稱干細胞)BLM、RecQ4蛋白表達變化，現分析結果并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：乳腺癌MDA-MB-435細胞由法國醫學科學研究院陸核教授饋贈。動物：雌性BALB/c系裸鼠18只，SPF級，4～6周齡，體質量16～20 g，合格證號為S1K(黔)2002-0001，購于貴州醫科大學動物房。試劑：recombinant Human EGF、Recombinant Human FGF-Basic、B27 Supplement(50×) 均購自美國Peprotech公司，鼠抗人CD24-FITC抗體、兔抗人CD44-PE抗體、同型對照均購自美國eBioscience公司，RecQ4抗體、BLM抗體、RecQ5抗體和β-actin抗體均購自美國Proteintech公司。

1.2 干細胞分離及鑒定

1.2.1 干細胞分離 采用無血清培養法。取對數生長期MDA-MB-435細胞，PBS洗滌細胞2次，吸盡PBS液，加入胰酶消化2～3 min。采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培養基中止消化，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清。采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培養基重懸細胞，臺盼藍染色計數。將細胞以2×104個/mL接種至培養瓶，加入含生長因子的無血清DMEM/F12(1∶1)培養基至8～10 mL，放入37 ℃、5% CO2培養箱中懸浮培養。采取半換液法進行培養，當培養基顏色變黃時，進行全換液法培養。懸浮培養3～4周，200倍光鏡下觀察其生長情況可見：存活下來的MDA-MB-435細胞(簡稱分離細胞)在完全培養基中貼壁生長，呈長梭形；轉入無血清培養基培養后，隨著培養時間延長，細胞由梭形變為圓形，呈懸浮生長，并成串形成微球體，細胞數量逐漸增多。

1.2.2 干細胞鑒定 將MDA-MB-435細胞去掉培養基后PBS沖洗2次，胰酶消化細胞。將懸浮細胞移入離心管中，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清。將其與1.2.1中的分離細胞采用PBS沖洗2遍，重懸成密度為2×107個/mL的單細胞懸液。各取50 μL單細胞懸液于離心管中，分別加入50 μL PBS混勻，同時設實驗管、空白管、同型對照管。實驗管中加入5 μL CD44-FITC、0.625 μL CD24-PE，4 ℃避光孵育30 min。PBS沖洗2遍，加入500 μL PBS重懸細胞，制成單細胞懸液。空白管不加入抗體，同型對照管加入同型對照抗體，其余步驟同實驗管。采用流式細胞儀檢測細胞膜表面CD44 CD24各表型細胞比例，包括CD44-CD24+、CD44-CD24-、CD44 + CD24-/low、CD44+CD24+(其中CD44+CD24-/low為干細胞表面標志物)，實驗重復3次。結果顯示，分離細胞膜表面CD44+CD24-/low比例明顯高于、CD44+CD24+比例明顯低于乳腺癌MDA-MB-435細胞(P均<0.05)；兩種細胞膜表面CD44-CD24+、CD44-CD24-比例比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；見表1。證實分離細胞為干細胞。

表1 MDA-MB-435及分離細胞膜表面CD44CD24各表型細胞比例比較±s)

注：與MDA-MB-435細胞比較，*P<0.05。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 成瘤能力 參照上述方法將MDA-MB-435細胞和干細胞分別制成單細胞懸液，臺盼藍染色計數，分別將其密度調整為1×105、1×104、1×103個/mL，4 ℃條件下保存。將18只雌性裸鼠隨機分為6組，每組3只。各組均于兩側腋窩分別皮下注射上述密度的MDA-MB-435細胞和干細胞懸液100 μL。接種后將裸鼠送回SPF級飼養室飼養，每天定時觀察腫瘤生長情況，記錄成瘤時間。每周固定時間采用游標卡尺測量腫瘤結節的最長徑(a)和垂直方向最短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，V=0.5ab2，共12周。

1.3.2 ATP結合盒膜轉運蛋白G2(ABCG2)mRNA表達 采用RT-PCR法檢測。取MDA-MB-435細胞和干細胞分別加入裂解液，用加樣器吹打數次，15～30 ℃放置5 min。按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，采用M-MLV第一鏈合成系統試劑盒逆轉錄成cDNA。ABCG2上游引物：5′-TTAGGATTGAAGCCAAAGG-3′，下游引物：5′-TAGGCAATTGTGAGGCAATGAG-3′，擴增長度446 bp；以β-actin為內參，上游引物：5′-GTCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游引物：5′-CGTCACACTTCATGATGGAGTT-3′，擴增長度121 bp。PCR反應體系25 μL：上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 2 μL(0. 2 μg)，去離子水補足至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；70 ℃延伸10 min。采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，120 V電泳30 min。凝膠成像儀進行拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析灰度值。以目的基因與β-actin基因擴增產物電泳條帶灰度值的比值計算ABCG2 mRNA相對表達量。

1.3.3 BLM、RecQ4蛋白表達 ①Western blotting法：采用蛋白抽提試劑盒提取MDA-MB-435細胞和干細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。配制8% SDS-PAGE、12% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，濃縮膠電泳80 V，分離膠電泳120 V，當溴酚藍剛跑出即可終止電泳。PVDF轉膜，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日在室溫下脫色搖床上搖動孵育1 h，TBST沖洗3次。加入HRP標記羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫下孵育1 h，TBST沖洗3次，進行電泳蛋白條帶顯影。以Histone H3.1為內參，采用掃描儀將膠片結果進行掃描，凝膠圖象處理系統分析灰度值。以目的蛋白和內參蛋白灰度值的比值計算BLM、RecQ4蛋白相對表達量。②免疫組化法：將MDA-MB-43細胞和干細胞用預溫的PBS沖洗3次，每次10 min。加入4%多聚甲醛室溫固定20～30 min，PBS沖洗3次，每次10 min。采用0.2% TritonX-100透化10 min，加入5%羊血清室溫封閉30 min。加入BLM、RecQ5抗體(用1%羊血清稀釋)，4 ℃過夜。PBS沖洗3次后加入Cy3標記的山羊抗兔IgG(用1%羊血清稀釋)，室溫避光孵育30 min。采用PBS沖洗3次，加入1% Hoechst33342(用PBS稀釋)，室溫避光孵育5 min，PBS沖洗3次，每次10 min。加入抗熒光衰減劑，95%甘油封片。熒光顯微鏡下拍照，采用Image J軟件分析光密度值。

2 結果

2.1 成瘤能力 接種1×105個/mL MDA-MB-435細胞的裸鼠于接種后第36天出現結節，接種1×105、1×104個/mL干細胞的裸鼠分別于接種后第23、30天出現結節，并逐漸增大。接種1×104、1×103個/mL MDA-MB-435細胞和接種1×103個/mL干細胞的裸鼠均未成瘤。與接種相同密度MDA-MB-435細胞比較，接種干細胞的裸鼠成瘤時間早、腫瘤體積大。裸鼠接種不同密度MDA-MB-435細胞和干細胞后1～3周均未成瘤，裸鼠接種MDA-MB-435細胞和干細胞后4～12周成瘤體積比較見表2。

表2 裸鼠接種MDA-MB-435細胞和干細胞后4～12周成瘤體積比較

注：與MDA-MB-435細胞同濃度、同時間比較，*P<0.01。

2.2 ABCG2 mRNA表達 干細胞及MDA-MB-435細胞ABCG2 mRNA相對表達量分別為0.753±0.025、0.563±0.112；兩者比較P<0.05。

2.3 BLM、RecQ4蛋白表達 Western blotting法：干細胞及MDA-MB-435細胞BLM蛋白相對表達量分別為0.92±0.01、0.77±0.03，RecQ4蛋白相對表達量分別為0.78±0.01、0.95±0.03，兩者比較P均<0.05。免疫組化法：干細胞及MDA-MB-435細胞BLM蛋白表達(光密度值)分別為0.042±0.002、0.032±0.001，RecQ4蛋白表達分別為0.056±0.002、0.076±0.001，兩者比較P均<0.05。

3 討論

朱敬之等[4]在無血清培養基中添加了bFGF、EGF、B27等只維持細胞生存的必需營養物質，發現可使腫瘤干細胞增殖而形成微球體，維持不分化的狀態；而非腫瘤干細胞則貼壁生長，最后死亡。本研究采用無血清培養法富集MDA-MB-435細胞中的干細胞，研究結果顯示，干細胞CD44+/CD24-/low比例明顯高于MDA-MB-435細胞，說明成功從MDA-MB-435細胞中篩選出干細胞。

研究證實，腫瘤干細胞能在裸鼠體內形成完整的惡性腫瘤，并且有與原發腫瘤相似的組織學特性；體內高致瘤性是腫瘤干細胞重要的特性之一。郭崇勇等[5]研究表明，富集的腫瘤干細胞體內成瘤性明顯高于乳腺癌MCF-7細胞。本研究裸鼠成瘤實驗結果顯示，與MDA-MB-435細胞比較，接種同樣密度干細胞的裸鼠成瘤時間早、腫瘤體積較大。ABCG2是一種多藥耐藥基因，均可以作為各種來源干細胞的重要標志物，在腫瘤干細胞的侵襲和轉移中扮演重要角色[6]。Hiraga等[7]研究發現，MDA-MB-231細胞中ABCG2 mRNA在側群細胞的表達明顯高于非側群細胞。本研究結果顯示，干細胞ABCG2 mRNA相對表達量明顯高于MDA-MB-435細胞。以上說明乳腺癌干細胞具有高成瘤能力和高耐藥性。

RecQ解旋酶是一個高度保守的蛋白質家族，在保持基因組的完整性上具有關鍵作用。Sassi等[8]研究發現，BLM基因突變可能與乳腺癌的發生有關。RecQ4與p53可阻止mtDNA的不穩定性，從而抑制腫瘤的發生[9]。RecQ4被認為與血液惡性腫瘤的發生相關，還可通過與生存素結合而避免乳腺癌細胞凋亡[10]。但不僅RecQ4的突變會導致腫瘤的發生，其過量表達也會引骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌和宮頸癌等腫瘤的發生[11,12]。研究表明，RecQ4在乳腺癌細胞中呈高表達，其與生存素結合而抑制乳腺癌細胞的凋亡[13]。Lao等[14]研究表明，在直腸癌組織中BLM和RecQ4表達均增加。本研究Western blotting法和免疫組化法檢測結果均顯示，干細胞BLM蛋白表達低于MDA-MB-435細胞，RecQ4蛋白表達高于MDA-MB-435細胞。

綜上所述，乳腺癌干細胞BLM蛋白表達降低、RecQ4蛋白表達升高，可能與其耐藥性和成瘤能力強有關。

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Expression changes and significance of BLM and RecQ4 helicases in breast cancer stem cells

LUYuan,GEZhangwen,LIUJielin

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To investigate the expression changes of BLM and RecQ4 helicases in breast cancer stem cells. Methods Breast cancer stem cells were screened from breast cancer MDA-MB-435 cells and were cultured in serum-free medium. The tumorigenicity of breast cancer stem cells and MDA-MB-435 cells was observed by tumor formation in nude mice. The drug resistance gene ATP-binding cassette transporter G2(ABCG2)mRNA of stem cells was detected by RT-PCR. The protein expression of BLM and RecQ4 was detected in breast cancer MDA-MB-435 cells and their stem cells by Western Blotting and fluorescent staining. Results The proportion of surface markers CD44+CD24-/lowin cancer stem cells was significantly higher, but the proportion of membrane surface CD44+CD24+was significantly lower than that of MDA-MB-435 cells (allP<0.05). No statistical significance was found in the proportions of cell membrane surface CD44-CD24+and CD44-CD24-between these two kinds of cells (allP<0.05). The mRNA expression of ABCG2 was 0.753±0.025 in stem cells, and it was 0.563±0.112 in the breast cancer MDA-MB-435 cells (P<0.05). Compared with the nude mice inoculated with the same density of MDA-MB-435 cells, the nude mice inoculated with stem cells had an early tumor formation time and a large tumor volume. The BLM protein expression of stem cells was lower and RecQ4 protein expression was higher than that of MDA-MB-435 cells (allP<0.05). Conclusion The tumorigenicity is high in breast cancer stem cells, which may be associated with low expression of BLM and high expression of RecQ4 in breast cancer stem cells.

breast carcinoma; serum-free culture; breast cancer stem cells; RecQ family helicases

國家自然科學基金資助項目(81360349)；貴州省優秀科技教育人才省長專項基金資助項目[黔科合字(2006)57號]。

魯媛(1987-)，女，碩士，研究方向為腫瘤免疫學。E-mail: luyuanuse@163.com

劉杰麟(1963-)，男，教授，碩士生導師，研究方向為臨床免疫學。E-mail： liujlin63@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.003

R392.9

A

1002-266X(2017)04-0017-04

2015-02-03)