高血壓小鼠心肌肥厚過程中心肌組織Prx-2、8-OHdG蛋白表達(dá)變化及意義

王若楠，范玉磊，梁婷婷，耿小番，劉璇，姚程，孫影

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000)

高血壓小鼠心肌肥厚過程中心肌組織Prx-2、8-OHdG蛋白表達(dá)變化及意義

王若楠，范玉磊，梁婷婷，耿小番，劉璇，姚程，孫影

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000)

目的 探討高血壓小鼠心肌肥厚過程中心肌組織硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶2(Prx-2)、8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)蛋白表達(dá)變化及其意義。方法 將60只雄性C57BL/6N小鼠分為觀察組40只和對(duì)照組20只，觀察組采用兩腎一夾(2K1C)法制備高血壓心肌肥厚模型，對(duì)照組只分離左腎動(dòng)脈，不放置腎動(dòng)脈夾。兩組分別于術(shù)前和術(shù)后2、4、8、12周測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓；術(shù)后2、4、8、12周分別隨機(jī)選擇10只觀察組小鼠及5只對(duì)照組小鼠處死，計(jì)算全心質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)，分別采用免疫印跡法、免疫組化法檢測(cè)左心室心肌組織Prx-2、8-OHdG蛋白表達(dá)；分析觀察組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Prx-2、8-OHdG蛋白表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果 兩組術(shù)前尾動(dòng)脈收縮壓比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，觀察組術(shù)后2、4、8、12周尾動(dòng)脈收縮壓、全心質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)均呈升高趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)；證實(shí)建模成功。觀察組術(shù)后2、4、8、12周左心室心肌組織Prx-2蛋白相對(duì)表達(dá)量及8-OHdG蛋白表達(dá)均呈升高趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)。觀察組術(shù)后2、4、8、12周左心室心肌組織8-OHdG和Prx-2蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.95、0.97、0.97和0.95，P均<0.01)。結(jié)論 高血壓小鼠心肌肥厚過程中左心室心肌組織Prx-2、8-OHdG蛋白表達(dá)均升高，二者分別通過抗氧化和促氧化作用參與心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展。

高血壓；硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶2；8-羥基脫氧鳥嘌呤；心肌肥厚；活性氧；小鼠

心肌肥厚是高血壓累及心臟最常見的表現(xiàn)，長(zhǎng)期心肌肥厚會(huì)導(dǎo)致慢性心力衰竭。研究顯示，氧化應(yīng)激是引起心肌肥厚的重要原因之一[1]。氧化應(yīng)激是指細(xì)胞中促氧化與抗氧化體系之間的平衡失調(diào)，促氧化因素增多，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂。活性氧(ROS)是促氧化的主要物質(zhì)，具有強(qiáng)氧化潛能，8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)是ROS攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子形成的產(chǎn)物，是反映ROS水平的可靠標(biāo)志物[2, 3]。硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶-2(Prx-2)是一種新型過氧化物酶，其在多種疾病中表達(dá)升高，可通過抗氧化作用而減少ROS引起的氧化應(yīng)激損傷[4, 5]。目前關(guān)于Prx-2及8-OHdG在高血壓誘導(dǎo)心肌肥厚過程中的表達(dá)變化鮮見報(bào)道。為此，我們于2013年1月～2015年6月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60只C57BL/6小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，均為雄性，體質(zhì)量(22.4±0.8)g。主要試劑及儀器：銀質(zhì)腎動(dòng)脈夾(內(nèi)徑0.15 mm)購(gòu)于上海奧旺醫(yī)療器械有限公司，Prx-2抗體、8-OHdG抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，小鼠無創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x購(gòu)于上海奧爾科特生物科技有限公司，單壓力心臟導(dǎo)管購(gòu)于美國(guó)Scisence公司。

1.2 高血壓心肌肥厚模型制備 將60只C57BL/6小鼠分為觀察組40只和對(duì)照組20只。觀察組采用兩腎一夾(2K1C)法制備高血壓高血壓心肌肥厚模型：小鼠以1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位進(jìn)行固定，于腹正中作一1.5 cm切口，切開腹腔后暴露左腎；鈍性分離左腎動(dòng)脈，銀質(zhì)腎動(dòng)脈夾鉗夾左腎動(dòng)脈，關(guān)閉切口。對(duì)照組只分離左腎動(dòng)脈，不放置腎動(dòng)脈夾。兩組術(shù)后均自由進(jìn)食和飲水。 術(shù)前和術(shù)后2、4、8、12周采用無創(chuàng)血壓儀通過鼠尾動(dòng)脈袖套法測(cè)量?jī)山M清醒狀態(tài)下的尾動(dòng)脈收縮壓。每次尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定后分別隨機(jī)選擇觀察組10只及對(duì)照組5只處死，迅速取出心臟，濾紙吸干水分后稱質(zhì)量，分離左、右心房和左、右心室并稱重，計(jì)算全心質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)。全心質(zhì)量指數(shù)=全心質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)，左心室質(zhì)量指數(shù)=左心室質(zhì)量 (mg)/體質(zhì)量 (g)。結(jié)果顯示，兩組術(shù)前尾動(dòng)脈收縮壓比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，觀察組術(shù)后2、4、8、12周尾動(dòng)脈收縮壓均明顯高于術(shù)前及對(duì)照組術(shù)后同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)。見表1。觀察組術(shù)后2、4、8、12周全心質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)均呈升高趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)。見表2、3。本研究?jī)山M術(shù)前尾動(dòng)脈收縮壓比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但觀察組術(shù)后2、4、8、12周尾動(dòng)脈收縮壓均明顯高于術(shù)前及對(duì)照組術(shù)后同時(shí)間點(diǎn)；觀察組術(shù)后2、4、8、12周全心質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)均呈升高趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)。提示高血壓心肌肥厚模型制備成功。

表1 兩組造模前后尾動(dòng)脈收縮壓比較±s)

注：與同組術(shù)前比較，*P<0.05；與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

表2 兩組造模后全心質(zhì)量指數(shù)比較±s)

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

表3 兩組造模后左心質(zhì)量指數(shù)比較±s)

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 左心室心肌組織Prx-2蛋白表達(dá) 采用免疫印跡法。將兩組術(shù)后2、4、8、12周稱重后的左心室心肌組織分為兩部分進(jìn)行凍存，分別用于檢測(cè)Prx-2和8-OHdG蛋白表達(dá)。取其中一部分凍存的左心室心肌組織，加入蛋白裂解液進(jìn)行裂解，超聲波擊碎后，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，-70 ℃保存。考馬斯亮藍(lán)R-250染色測(cè)定蛋白濃度，取50 μg總蛋白進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入Prx-2和GAPDH一抗(1∶10 00稀釋)后4 ℃孵育過夜，加入二抗 (1∶3 000稀釋)后室溫孵育45 min，NBT/BCIP顯色劑顯色。采用Image J軟件掃描并分析蛋白表達(dá)條帶的灰度值，Prx-2與GAPDH的灰度值比值為Prx-2相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 左心室心肌組織8-OHdG蛋白表達(dá) 采用免疫組化法。將另一部分左心室心肌組織冰凍切片室溫晾干后，4 ℃丙酮固定10 min，PBS洗滌。37 ℃10%驢血清封閉1 h，滴加8-OHdG一抗(1∶50稀釋)，4 ℃過夜后滴加熒光二抗Dylight549，常溫避光1 h后封片。每張切片于400倍光鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，8-OHdG陽性表達(dá)呈紅色熒光；采用IPP圖像軟件分析心肌細(xì)胞的積分光密度(IOD)值，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組左心室心肌組織Prx-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 觀察組術(shù)后2、4、8、12周左心心肌組織Prx-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈升高趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)。見表4、圖1。

表4 兩組手術(shù)后左心室心肌組織Prx-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

注：1～4為對(duì)照組術(shù)后2、4、8、12周；5～8:2K1C術(shù)后組2、4、8、12周。

圖1 兩組左心心肌組織Prx-2蛋白曲泳結(jié)果

2.2 兩組左心室心肌組織8-OHdG蛋白表達(dá)比較 觀察組術(shù)后2、4、8、12周左心心肌組織8-OHdG蛋白表達(dá)呈升高趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)。見表5。

表5 兩組手術(shù)后左心室心肌組織8-OHdG蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

2.3 左心室心肌組織8-OHdG與Prx-2表達(dá)的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，觀察組術(shù)后2、4、8、12周左心室心肌組織中8-OHdG和Prx-2蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.95、0.97、0.97和0.95，P均<0.01)。

3 討論

高血壓引起的心臟結(jié)構(gòu)重建主要為左心室肥厚，是心臟對(duì)慢性壓力和容量超負(fù)荷的適應(yīng)性變化，也是高血壓的一種常見的并發(fā)癥，早期代償性表現(xiàn)為向心性肥厚，晚期則失代償表現(xiàn)為離心性肥厚，進(jìn)而心功能下降，最終導(dǎo)致心力衰竭。

研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化小鼠內(nèi)源性ROS水平增高，并伴有Prx-2高表達(dá)；如果Prx-2缺乏，則加重小鼠動(dòng)脈粥樣硬化損傷[15]。Zhao等[16]報(bào)道，心臟缺血再灌注小鼠心肌細(xì)胞中Prx-2表達(dá)減少，ROS表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡率升高；提高Prx-2表達(dá)可降低H2O2水平，并通過抑制caspase 3、9、12和激活Bcl-2途徑，減少心肌細(xì)胞凋亡，表明Prx-2對(duì)ROS引起的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。本研究觀察組術(shù)后2、4、8、12周左心室心肌組織Prx-2蛋白相對(duì)表達(dá)量呈升高趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)。

在正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體的抗氧化能力和氧化損傷之間保持著相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS能迅速被機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除。但在某些病理情況下，機(jī)體抗氧化防御能力下降，受有害刺激時(shí)ROS產(chǎn)生增多，就會(huì)出現(xiàn)體內(nèi)ROS產(chǎn)生增加和(或)清除減少，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)蓄積，引發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的組織損傷[7, 8]。堿基配對(duì)時(shí)8-OHdG與腺嘌呤A配對(duì)，導(dǎo)致DNA鏈G:C→T:A顛換，這種突變難以修復(fù)或修復(fù)極慢，因此8-OHdG蛋白表達(dá)可以反映機(jī)體DNA氧化損傷程度，是一個(gè)可靠的評(píng)價(jià)機(jī)體DNA氧化損傷和氧化應(yīng)激狀態(tài)的標(biāo)志物[9]。研究表明，在心肌肥厚的發(fā)展過程中，心肌細(xì)胞耗氧逐漸增加，線粒體氧化磷酸化加強(qiáng)，電子傳遞鏈中氧泄漏增多，線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，如不及時(shí)清除則會(huì)造成細(xì)胞的損傷甚至死亡[10, 11]。本研究觀察組術(shù)后2、4、8、12周左心室心肌組織8-OHdG蛋白表達(dá)呈升高趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)；說明腎性高血壓可引起心肌組織ROS產(chǎn)生和清除嚴(yán)重失衡，使ROS在心肌細(xì)胞內(nèi)蓄積，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，直接引起心肌細(xì)胞的氧化損傷。病理狀態(tài)下，增高的ROS作為第二信使傳遞AngⅡ等細(xì)胞外信號(hào)，通過激活多種細(xì)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)傳遞信號(hào)和轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)心肌肥厚基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和心肌肥厚[11, 12]。研究表明，在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病中ROS水平增高，相應(yīng)的Prx-2蛋白表達(dá)也上調(diào)，發(fā)揮其抗氧化作用[13, 14]。本研究觀察組術(shù)后2、4、8、12周左心室心肌組織中8-OHdG和Prx-2表達(dá)均呈正相關(guān)。以上提示高血壓小鼠心肌肥厚過程中心肌組織ROS表達(dá)增加。為降低ROS引起的氧化應(yīng)激損傷，機(jī)體通過高表達(dá)Prx-2以清除增多的ROS。

綜上所述，高血壓小鼠心肌肥厚過程中心肌組織Prx-2、8-OHdG蛋白表達(dá)均升高，二者分別通過發(fā)揮抗氧化和促氧化作用參與心肌肥厚的發(fā)生。

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Expression changes of Prx-2 and 8-OHdG protein in mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy

WANGRuonan,FANYulei,LIANGTingting,GENGXiaofan,LIUXuan,YAOCheng,SUNYing

(SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the expression and significance of peroxiredoxin-2 (Prx-2) and 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OHdG) in mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy. Methods Sixty male mice were randomly divided into the observation group (n=40) and control group (n=20). Mice in the observation group received 2-kidney1-clip (2K1C) to make the models of mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy, while there was no silver clip in mice of the control group. The systolic blood pressure (SBP) was measured in all mice before the operation, and 2, 4, 8 and 12 weeks after 2K1C. Ten mice in observation group and five mice in the control group were scarified at 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery to measure the whole heart quality index and left ventricle quality index. Prx-2 and 8-OHdG protein expression was detected by Western blotting and Immunohistochemistry. And then, we analyzed the correlation between Prx-2 and 8-OHdG. Results No significant difference was found in the preoperative SBP between the control and observation groups (P>0.05). Compared with the control group, SBP, whole heart quality index and left ventricle quality index was increased in the observation group at 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery, indicating that the hypertension model was successful (allP<0.05). The expression levels of 8-OHdG and Prx-2 protein in the observation group at 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery were significantly higher than those of the control group (allP<0.05), and the expression levels of 8-OHdG and Prx-2 protein was positively correlated with each other (r=0.95, 0.97, 0.97 and 0.95,P<0.05). Conclusion The expression levels of Prx-2 and 8-OHdG in mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy are increased, and they participate the occurrence and development of myocardial hypertrophy through oxidation and anti-oxidation.

hypertension; peroxiredoxin-2; 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine; myocardial hypertrophy; reactive oxygen; mice

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81200188)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410081023)。

王若楠(1992-)，女，研究方向?yàn)楦哐獕旱陌l(fā)病機(jī)制。E-mail: 764024174@qq.com

孫影(1976-)，女，教授，研究方向?yàn)楦哐獕旱陌l(fā)病機(jī)制。E-mail: 1565756268@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.007

R544.1

A

1002-266X(2017)04-0005-04

2015-01-14)