人Tudor-SN UTR片段熒光素酶報告基因表達質粒的構建及活性檢測

趙亞麗，蘇超，甘世虎，任媛媛，高星杰，楊潔，何津巖

(天津醫科大學，天津300070)

·論著·

人Tudor-SN UTR片段熒光素酶報告基因表達質粒的構建及活性檢測

趙亞麗，蘇超，甘世虎，任媛媛，高星杰，楊潔，何津巖

(天津醫科大學，天津300070)

目的 為深入研究Tudor-SN蛋白本身在翻譯水平的調控機制奠定基礎。方法 以HeLa細胞全基因組DNA為模板，PCR擴增出目的基因，利用雙酶切的方法將目的片段連接到pGL3-Control載體上。再將構建成功的pGL3-5′UTR、pGL3-3′UTR重組質粒分別與內參海腎熒光素酶質粒瞬時共轉染HeLa細胞，培養48 h檢測熒光素酶的活性。結果 雙酶切和基因測序法鑒定重組質粒構建成功，轉染重組質粒后可檢測到熒光素酶的活性；以pGL3-5′UTR質粒熒光素酶活性最高。結論 成功構建了人Tudor-SN基因5′UTR和3′UTR序列的重組質粒，為研究Tudor-SN基因UTR區對翻譯調控的影響奠定了基礎。

人Tudor-SN蛋白；5′UTR；3′UTR；重組質粒；熒光素酶

Tudor-SN蛋白又常被稱為SND1蛋白，該蛋白于1995年首次作為EB病毒細胞核抗原2(EBNA2)的轉錄調控激活因子被發現[1]。通過疏水簇結構域(HCA)分析可知，Tudor-SN蛋白由N端重復的4個葡萄球菌核酸酶類似物(SN)和C端的TSN片段組成[2]。近年研究發現，Tudor-SN多功能蛋白參與很多生物學行為，如細胞的應激反應[3]、脂代謝[4]，細胞周期調控[5]，pre-mRNA的剪切加工[6]和基因的表達調控[7]等。目前關于Tudor-SN蛋白自身表達調控的研究鮮見。2016年5～8月，本研究采用pGL3-Control質粒載體構建Tudor-SN UTR區域的熒光素酶重組質粒，旨在為深入研究Tudor-SN蛋白在翻譯水平的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pGL3-Control螢火蟲熒光素酶基因表達載體、雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；限制性內切酶Hind Ⅲ、Nco Ⅰ、Xba Ⅰ、Hpa Ⅰ、T4 DNA Ligase購自Thermo公司；Lipofectamine? 2000購自Invitrogen公司；去內毒素質粒提取試劑盒、基因組DNA抽提試劑盒購自Omega公司，DNA快速膠回收提取試劑盒購自BIOMIGA公司；引物合成、基因測序由GENEWIZ公司完成；ONPG購自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養基購自Hyclone公司；HeLa細胞、內參海腎熒光素酶質粒為本課題組保存。1.2 Tudor-SN基因5′UTR、3′UTR序列引物設計 利用NCBI、UCSC網站明確人Tudor-SN基因的5′UTR、3′UTR序列，設計引物：5′UTR上游引物：5′-CAAGCTTACGCTTGCGCGGCGAGTAG-3′，下游引物：5′-GCCATGGGTGTGGAGATGCAAAGGCA-3′；3′UTR上游引物：5′-CTCTAGAGGAGGGGATCGGGTTTGGCC-3′，下游引物：5′-GGTTAACTTTTTTTTTTTTTTTGATCAA-3′(上、下游引物中，加粗部分分別代表引入的酶切位點的序列，5′UTR：Hind Ⅲ和Nco Ⅰ，3′UTR：Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ)。以5′UTR、3′UTR序列片段構建質粒。為了更準確體現5′UTR和3′UTR序列的功能，我們模擬UTR在Tudor-SN基因中的位置，將5′UTR插入到Luc基因之前，3′UTR插入到Luc基因之后，相關模式圖見圖1。

圖1 Luciferase質粒插入5′UTR和3′UTR片段的模式圖

1.3 基因組DNA提取及目的片段5′UTR和3′UTR擴增 用基因組DNA提取試劑盒提取HeLa細胞的DNA作為PCR擴增模板，采用25 μL體系，擴增參數為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；33個循環，PCR循環完成后72 ℃再延伸5 min，4 ℃終止反應。取 PCR產物10 μL行1%的瓊脂糖凝膠電泳，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR擴增產物。預測擴增的人Tudor-SN基因的5′UTR目的片段長度為226 bp，3′UTR目的片段的長度為560 bp。

1.4 線性pGL3-Control載體的獲取 用質粒小提試劑盒提取pGL3-Control 質粒DNA，分別用Hind Ⅲ和Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ進行雙酶切，完整切下pGL3-Control 質粒載體，瓊脂糖凝膠電泳。凝膠回收試劑盒回收得到約5 000 bp的線性pGL3-Control。1.5 重組質粒pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR構建、酶切鑒定及測序 需要構建的重組質粒pGL3-5′UTR是將5′UTR插入到pGL3-Control 質粒載體的Luc基因之前，Hind Ⅲ和Nco Ⅰ酶切位點之間，pGL3-3′UTR是將3′UTR插入到pGL3-Control質粒載體的Luc基因之后，Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ酶切位點之間，所以我們用Hind Ⅲ和Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ分別雙酶切pGL3-Control質粒載體，其線性化后，切下目的條帶，用凝膠回收試劑盒回收純化酶切產物。將Tudor-SN的5′UTR、3′UTR目的片段與酶切的線性載體以3∶1的比例在T4 DNA連接酶的作用下室溫反應60 min，取連接后的產物5 μL，加入到50 μL DH5α感受態細菌中彈勻，冰上靜置15 min，42 ℃熱激30 s，冰上冷激2 min，加入500 μL液體LB培基，37 ℃搖床孵育1.5 h，在含有氨芐霉素(25 μg/mL)的LB平板上涂布轉化后的菌液，待液體吸收后，倒置于37 ℃生化培養箱過夜。連接產物的平板上有菌落長出后，挑取3個單克隆菌落，分別接種于含氨芐霉素(25 μg/mL)的20 mL液體LB培養基中，37 ℃搖床過夜。第二天提取質粒酶切鑒定，同時對菌液進行測序。

1.6 重組質粒pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR熒光素酶活性鑒定

1.6.1 重組質粒轉染 用脂質體轉染法將pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR分別與海腎熒光素酶表達質粒(內參)共轉入HeLa細胞中(以24孔板為例)。具體步驟：①HeLa細胞融合度為60%時轉染，轉染前換成新鮮培基；②分別用25 μL無血清的opti-MEM培養液稀釋質粒1 μg(內參質粒為250 ng)和轉染試劑Lipofectamine?2000 2 μL，輕彈混勻室溫靜置5 min；③將稀釋的質粒和Lipofectamine?2000混勻，室溫靜置15 min；④ 混懸液緩慢均勻加入含500 μL培養基的細胞孔中，搖勻；⑤正常培養48 h后收集樣品，進行熒光素酶的活性檢測。

1.6.2 熒光素酶活性檢測 轉染48 h后，棄去培基，用冷的1×PBS洗3次，棄干凈；每孔加被動裂解液100 μL，室溫慢搖20 min；將裂解液轉移至離心管中，渦旋2次、每次10 s，10 000 r/min離心5 min，取上清至新的離心管中；取20 μL裂解液和100 μL LARII混勻，熒光發光計檢測螢火蟲熒光素酶的活性，然后向同一孔中加入等量的Stop & Glo?檢測海腎熒光素酶的活性，每個實驗做3個復孔。

2 結果

2.1 Tudor-SN的5′UTR和3′UTR PCR擴增結果 以HeLa細胞全基因組DNA為模板，用含酶切位點的引物進行PCR擴增，2%的瓊脂糖膠電泳結果顯示產物5′UTR(圖2A)、3′UTR(圖2B)在相應的位置有明顯的條帶，說明擴增出的目的條帶與預期產物5′UTR 長度226 bp，3′UTR長度560 bp相符。

注：M為Trans2K DNA maker；1為5′UTR(226 bp)；2為3′UTR(560 bp)。

圖2 線性目的片段5′UTR和3′UTR的獲取

2.2 線性pGL3-Control載體的獲取結果 用Hind Ⅲ和Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ分別雙酶切pGL3-Control質粒載體后，1%的瓊脂糖凝膠電泳分析線性化質粒載體，顯示條帶分別出現在約5 000 bp(圖3A、B)，回收純化該片段。

注：M為Trans2K Plus Ⅱ DNA maker；1為雙酶切前；2為雙酶切后。

圖3 線性pGL3-Control載體的獲取和鑒定

2.3 重組質粒pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR的構建、酶切鑒定及測序結果 在T4 DNA連接酶的作用下將純化的線性質粒載體pGL3-Control和目的片段5′UTR、3′UTR分別進行連接，經過轉化和擴增后再將構建的重組質粒pGL3-5′UTR用Hind Ⅲ、Nco Ⅰ雙酶切，重組質粒pGL3-3′UTR用Xba Ⅰ、Hpa Ⅰ雙酶切后鑒定。結果顯示，質粒pGL3-5′UTR雙酶切后，在200 bp左右(目的片段)與5 kb左右(載體片段)各切出一條帶(圖4A)，pGL3-3′UTR雙酶切后，在500 bp左右(目的片段)與5 kb左右(載體片段)各切出一條帶(圖4B)，表明5′UTR、3′UTR已插入到pGL3-Control質粒載體中。同時，依據堿基互補配對原則，用pGL3-Control的通用引物(5′-CTAGCAAATAGGCTGTCCC-3′和5′-CTTTATGTTTTTGGCG TCTTCCA-3′)以重組質粒為模板，進行基因測序，測序結果證明目的片段成功插入到pGL3-Control載體中，說明螢火蟲熒光素酶報告基因重組質粒構建成功。

注：M為Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker；1為雙酶切前；2為雙酶切后。

圖4 重組質粒pGL3- 5′UTR 、pGL3-3′UTR 的雙酶切鑒定

2.4 熒光素酶活性測定結果 將pGL3-5′UTR、pGL3-3′UTR重組質粒分別與內參海腎熒光素酶質粒共轉染入HeLa細胞中，轉染48 h后收樣品，檢測熒光素酶的相對活性分別為46.98±0.9和19.51±1.3。

3 討論

Tudor-SN多功能蛋白高度保守且廣泛存在于哺乳動物體內，參與很多生物學調控。一方面Tudor-SN蛋白可作為STAT6、E2F-1、PPARγ等基因的轉錄共激活因子參與基因的表達調控[5,8,9]。另一方面，Tudor-SN蛋白作為RNP的組成成分，可通過對一些基因pre-mRNA的剪切加工來發揮其表達調控作用[10～12]。后來的研究也揭示Tudor-SN蛋白通過促進腫瘤的增殖、侵襲和遷移能力，參與很多腫瘤的發生，比如前列腺癌[12]、乳腺癌[13]、肝癌[14]、肺癌[15]等。關于Tudor-SN蛋白的功能研究很多，但Tudor-SN蛋白自身表達調控的研究卻不常見。Armengol等[16]課題組研究發現，轉錄調控因子NF-κB、Sp1和NF-Y可參與Tudor-SN基因轉錄水平的調控，而關于Tudor-SN蛋白翻譯水平的調控目前尚無相關報道。

真核生物中涉及分化和發育的基因主要受mRNA的選擇性翻譯而調控，參與這種調節的序列大多群集于轉錄本的UTR，包括5′UTR和3′UTR。mRNA的5′UTR在基因表達的多個方面都做出了貢獻，包括mRNA的加工、折疊，維持穩定性，細胞內的運輸和定位以及增強翻譯效率等。3′UTR的功能包括保護mRNA的穩定性，保護5′帽結構并控制mRNA的亞細胞定位。除了以上的正性調控以外，5′UTR和3′UTR對基因表達也存在負性調控，并且已知的許多與生長發育相關的基因都是通過UTR參與基因的翻譯抑制。其中5′UTR對基因表達的負調控主要包括以下方面：5′UTR的序列中存在自身堿基配對時，可形成發卡式或莖環式的二級結構，當二級結構自由能達到一定值時，會阻礙核糖體小亞基在mRNA上的遷移掃描，對翻譯起始具有阻止作用[17]；基因中5′UTR長度不同的轉錄本起始翻譯的能力不同；另外5′UTR區域含有uAUG和uORF，該結構具有抑制翻譯的作用，主要通過以下幾種方式，如Ribosome掃描uORF合成短肽后過早的脫離mRNA、合成短肽后重新起始(re-initiation)ORF的翻譯、合成的短肽可能在延長或終止階段阻止翻譯的進行、uORF介導mRNA的降解等；除此之外，一些基因的5′UTR區含有RNA G-quadruplex motif結構，這種特殊的二級結構也能抑制翻譯[18]。3′UTR主要通過一系列調控元件來調控翻譯，如成熟miRNA可通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯；3′UTR的一個顯著poly A尾的長度與翻譯效率密切相關，當<50 nt時，翻譯抑制；>200 nt時，高效翻譯；3′UTR區域含有多個AUUUA序列組成的ARE結構，ARE與多種蛋白結合，一類蛋白結合了ARE后維持mRNA的穩定性，促進翻譯，另一類蛋白可以介導mRNA的降解或抑制翻譯等。

基因的表達調控是一個復雜的過程，很多基因或蛋白在行使某些生物學功能時會受到不同程度的調控。目前，報告基因系統被廣泛用于真核細胞表達調控的研究。利用報告基因系統研究表達調控可避免下游表達產物的干擾，能比較真實地反映調控序列的作用。本研究采用的pGL3-Control熒光素酶報告基因質粒特定的優點是其本身帶有啟動子序列能夠自身啟動轉錄表達，含有增強子序列可在多種哺乳動物中增強基因的表達，能研究某些特定片段在基因表達中的作用。

本研究成功構建了Tudor-SN的5′UTR、3′UTR熒光素酶報告基因質粒，為尋找Tudor-SN基因UTR區調控Tudor-SN蛋白的表達機制提供了依據。

[1] Tong X, Drapkin R, Yalamanchili R, et al. The Epstein-Barr virus nuclear protein 2 acidic domain forms a complex with a novel cellular coactivator that can interact with TFIIE[J]. Mol Cell Biol, 1995,15(9) 4735-4744.

[2] Callebaut I, Mornon JP. The human EBNA-2 coactivator p100: multidomain organization and relationship to the staphylococcal nuclease fold and to the tudor protein involved in Drosophila melanogaster development[J]. Biochem J, 1997,321(Pt 1):125-132.

[3] Gao X, Ge L, Shao J, et al. Tudor-SN interacts with and co-localizes with G3BP in stress granules under stress conditions[J]. FEBS Lett, 2010,584(16):3525-3532.

[4] Duan Z, Zhao X, Fu X, et al. Tudor-SN, a novel coactivator of peroxisome proliferator-activated receptor gamma protein, is essential for adipogenesis[J]. J Biol Chem, 2014,289(12):8364-8374.

[5] Su C, Zhang C, Tecle A, et al. Tudor staphylococcal nuclease (Tudor-SN), a novel regulator facilitating G1/S phase transition, acting as a co-activator of E2F-1 in cell cycle regulation[J]. J Biol Chem, 2015,290(11):7208-7220.

[6] Yang J, Valineva T, Hong J, et al. Transcriptional co-activator protein p100 interacts with snRNP proteins and facilitates the assembly of the spliceosome[J]. Nucleic Acids Res, 2007,35(13) 4485-4494.

[7] Liu X, Dong L, Zhang X, et al. Identification of p100 target promoters by chromatin immunoprecipitation- guided ligation and selection (ChIP-GLAS)[J]. Cell Mol Immunol, 2011,8(1):88-91.[8] Yang J, Aittomaki S, Pesu M, et al. Identification of p100 as a coactivator for STAT6 that bridges STAT6 with RNA polymerase II[J]. Embo Journal, 2002,21(18):4950-4958.

[9] Duan Z, Zhao X, Fu X, et al. Tudor-SN, a novel coactivator of peroxisome proliferator-activated receptor γ protein, is essential foradipogenesis[J]. J Biol Chem, 2014,289(12):8364-8374.

[10] Mayo LD, Donner DB. A phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway promotes translocation of Mdm2 from the cytoplasm to the nucleus[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001,98(20):11598-11603.

[11] Prives C. Doing the right thing: feedback control and p53[J]. Curr Opin Cell Biol, 1993,5(2):214-218.

[12] Cappellari M, Bielli P, Paronetto MP, et al. The transcriptional co-activator SND1 is a novel regulator of alternative splicing in prostate cancer cells[J]. Oncogene, 2014,33(29):3794-3802.

[13] Yu L, Liu X, Cui K, et al. SND1 Acts Downstream of TGFbeta1 and Upstream of Smurf1 to Promote Breast Cancer Metastasis[J]. Cancer Res, 2015,75(7):1275-1286.

[14] Santhekadur PK, Akiel M, Emdad L, et al. Staphylococcal nuclease domain containing-1 (SND1) promotes migration and invasion via angiotensin II type 1 receptor (AT1R) and TGF beta signaling[J]. Febs Open Bio, 2014,4(3):353-361.

[15] Chiosea S, Jelezcova E, Chandran U, et al. Overexpression of Dicer in precursor lesions of lung adenocarcinoma[J]. Cancer Res, 2007,67(5):2345-2350.

[16] Armengol S, Arretxe E, Rodriguez L, et al. NF-kappaB, Sp1 and NF-Y as transcriptional regulators of human SND1 gene[J]. Biochimie, 2013,95(4):735-742.

[17] Pickering BM, Willis AE. The implications of structured 5 ′ untranslated regions on translation and disease[J]. Semin Cell Dev Biol, 2005,16(1):39-47.

[18] Bugaut A, Balasubramanian S. 5′-UTR RNA G-quadruplexes: translation regulation and targeting[J]. Nucleic Acids Res, 2012,40(11):4727-4741.

Construction of human Tudor-SN UTR luciferase reporter gene expression plasmid and its activity detection

ZHAOYali,SUChao,GANShihu,RENYuanyuan,GAOXingjie,YANGJie,HEJinyan

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To lay a foundation for further study on the mechanism of Tudor-SN protein in translation. Methods The human Tudor-SN UTR fragments were amplified by PCR from genomic DNA extracted from HeLa cells, and then were inserted into pGL3-Control expression vector. HeLa cells were co-transfected with the renilla luciferase plasmid and recombinant pGL3-5′UTR plasmid or pGL3-3′UTR plasmid. After 48 hours, luciferase activity was detected. Results Both double enzyme digestion and gene sequencing confirmed the construction of recombinant plasmid was successful. The luciferase activity was detected after transfection, and the luciferase activity of pGL3-5′UTR plasmid was the best. Conclusion The recombinant plasmids of pGL3-5′UTR-luciferase and pGL3-3′UTR-luciferase are successfully constructed, which lays a foundation for further study of regulatory mechanisms of Tudor-SN genetic UTR in translation.

human Tudor-SN protein; 5′UTR; 3′UTR; recombinant plasmid; luciferase

國家杰出青年基金資助項目(31125012)；教育部“創新團隊發展計劃”(IRT13085)；國家自然科學基金資助項目(31170830/31370749/31571380)；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(青年基金項目)(15JCQNJC09900)；天津醫科大學青年基金項目(2015KYZQ03)。

趙亞麗(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為細胞生物學。E-mail： zhaoyalismile@126.com

何津巖(1972-)，女，碩士生導師，副教授，研究方向為細胞分子通路。E-mail： hejinyan@tijmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.006

Q591.2,Q784

A

1002-266X(2017)04-0001-04

2016-09-01)