攜帶PEDF基因的骨髓間充質干細胞對小鼠Lewis肺癌的抑制作用

陳巧玲, 白亦光, 肖東琴, 劉 康 ， 馮 剛*

(1川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院腫瘤分院，南充 637000； 2川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院骨科； 3川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所； *通訊作者，E-mail：lssmd18@gmail.com)

攜帶PEDF基因的骨髓間充質干細胞對小鼠Lewis肺癌的抑制作用

陳巧玲1, 白亦光2, 肖東琴3, 劉 康3， 馮 剛3*

(1川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院腫瘤分院，南充 637000；2川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院骨科；3川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所；*通訊作者，E-mail：lssmd18@gmail.com)

目的 探討編碼色素上皮衍生因子的重組腺病毒(Ad-PEDF)轉染的骨髓間充質干細胞(MSCs)對小鼠Lewis肺癌生長和轉移的抑制作用。 方法 采用藻酸鹽包裹腫瘤細胞實驗評估MSCs-PEDF對Lewis肺癌細胞(LL/2)誘導的新生血管形成的抑制作用。C57BL/6小鼠皮下接種LL/2細胞7 d后，將荷瘤小鼠分為4組，每組18只。每組小鼠分別給予尾靜脈注射100 μl PBS、1×108PFU Ad-PEDF、5×105MSCs-LacZ或5×105MSCs-PEDF；每3 d用游標卡尺測量一次腫瘤體積。接種后第30天每組處死8只小鼠觀察肺轉移結節，其余小鼠(n=10)繼續觀察生存期。 結果 藻酸鹽包裹實驗顯示，與其他三個對照組相比，MSCs-PEDF治療組的藻酸鹽珠表面呈現較少的毛細血管網，FITC標記的葡聚糖攝入量也較其他組低(P<0.01)。MSCs-PEDF組小鼠皮下腫瘤的體積明顯小于PBS組、Ad-PEDF組及MSCs-LacZ組[(1 038.8±139.0)mm3vs(2 897.7±274.9)mm3，(2 622.8±359.1)mm3，(3 019.2±360.9)mm3，P<0.01]。MSCs-PEDF組肺轉移結節數明顯少于PBS組、Ad-PEDF組及MSCs-LacZ組(3.2±2.4vs16.0±4.0，14.6±5.3，16.1±4.9，P<0.05)，MSCs-PEDF組小鼠的生存期較其他各對照組顯著延長(P<0.01)。 結論 MSCs-PEDF可抑制LL/2皮下瘤的生長和轉移，并可延長荷瘤小鼠生存期，提示通過腺病毒轉染使MSCs分泌PEDF可作為一種新的針對肺癌的治療方法。

間充質干細胞； 色素上皮衍生因子； 非小細胞肺癌； 基因治療

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(NSCLC)的發病率較高，是最常見的肺癌類型，約占肺癌總數的85%[1,2]。手術治療僅對早期NSCLC患者具有較好療效，而放療和化療則會產生嚴重的毒副作用。因此，亟待開發治療NSCLC的新策略。

色素上皮衍生因子(PEDF)是一種分子量為50 kD的外分泌糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制因子超家族成員，最初由Tombran-Tink等在胎兒視網膜色素上皮細胞中分離出來，后發現其廣泛表達于胚胎和成體組織中。由于PEDF選擇性抑制新生血管，而對已形成的血管則無太大影響，使其作為一個有吸引力的抗腫瘤血管生成候選因子而受到關注[3,4]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我更新和多向分化潛能的非造血系成體干細胞，目前研究發現其具有較低的免疫原性，并可向損傷組織及腫瘤組織靶向遷移。因此，MSCs作為基因和藥物的細胞載體顯示出巨大的應用前景，并越來越多地運用在腫瘤的基因治療中[5,6]。

本實驗室前期已成功將重組色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)轉染MSCs，并在體外采用Western Blot檢測到細胞培養上清液中的PEDF表達，ELISA檢測培養上清中PEDF濃度為(78.8±4.8)ng/ml。 HUVECs成管抑制實驗和遷移抑制實驗顯示，MSCs-PEDF分泌至培養液上清中的PEDF可顯著抑制HUVECs形成小管及向生長因子遷移，證明其分泌的是具有生物活性的PEDF蛋白。相關實驗方法及結論已形成論著發表于《西部醫學》[7]，在此基礎上，本研究建立小鼠Lewis肺癌(LL/2)皮下瘤模型，觀察攜帶PEDF基因的MSCs(MSCs-PEDF)在體內對腫瘤生長的抑制作用及小鼠生存期的影響，為腫瘤的靶向治療提供一種新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 小鼠LL/2肺癌細胞的培養

小鼠Lewis肺癌細胞株(LL/2)及HEK293細胞株均購于美國模式培養物儲藏所(American type culture collection,ATCC)。

將LL/2細胞置于含有10%胎牛血清及100 U/ml阿米卡星的DMEM培養基中，在37 ℃、5%CO2、95%濕度條件下的孵箱中培養，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代， 2-3 d傳代1次。

1.2 藻酸鹽包裹腫瘤細胞實驗

將藻酸鈉溶于無菌生理鹽水，使其終濃度為1.5%。收集對數生長期的LL/2細胞，將其用1.5%藻酸鈉溶液重懸。將該細胞懸液用100 μl加樣器緩慢滴入磁力攪拌的250 mmol/L氯化鈣溶液中，形成乳白色的藻酸鹽小珠，每粒小珠含有LL/2細胞約1×105個。8周齡的C57BL/6小鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，消毒并切開背部的皮膚，皮下植入2粒藻酸鹽小珠，縫合皮膚，外敷手術膠膜。次日小鼠隨機分為4組(3只/組)，每組小鼠分別予以尾靜脈注射100 μl PBS、1×108PFU Ad-PEDF、5×105MSCs-LacZ或5×105MSCs-PEDF。第12天，每只小鼠經尾靜脈注射100 μl FITC標記的葡聚糖(FITC-Dextran，100 mg/kg)。麻醉小鼠后解剖暴露出藻酸鹽顆粒(附帶部分皮膚)，在解剖顯微鏡下觀察并照相。注射FITC-Dextran 20 min后處死小鼠，取出藻酸鹽顆粒，加入2 ml生理鹽水后搗碎顆粒并混勻標本，室溫靜置1 h。1 500 r/min離心5 min，取上清液，用熒光酶標儀檢測。用不同濃度的FITC-Dextran制備標準曲線。

1.3 小鼠LL/2肺癌皮下瘤模型的建立

6-8周齡C57BL/6雌性小鼠，清潔動物，購自四川大學華西動物實驗中心。收集對數生長期的LL/2細胞，1 500 r/min離心3 min，細胞沉淀以無血清培養基洗滌3次，用血球計數板計數細胞數量后調整細胞密度為5×106/ml，無菌條件下送到動物室。在C57BL/6小鼠一側背部皮下接種LL/2細胞100 μl(5×105個細胞/只)。接種后7-8 d，腫瘤最大徑達到3-5 mm，小鼠腫瘤模型即建立成功。

1.4 小鼠分組及治療

將荷瘤小鼠隨機分為4組，每組8只。Ⅰ組：100 μl PBS；Ⅱ組：100 μl 1×108PFU Ad-PEDF病毒液；Ⅲ組：100 μl 5×105MSCs-LacZ；Ⅳ組：100 μl 5×105MSCs-PEDF。分別給予尾靜脈注射，每4 d注射1次，共給予2次治療。

我父親在省醫院看過，不過大醫院人多，幾百人排隊掛號、取藥。他可能意識到自己的病沒救了，整個人無精打采的，打完針就去睡覺，不愿和人說話。對于我來說，父母親這么大年紀，去大醫院我們不放心，但在莫多寺曼巴照顧得十分周到，我心里特別感謝。在莫多寺看病，活佛讓他一邊服藥，一邊鼓勵他參加寺院的開示和法會。可能是受活佛的教化，他完全放開了，感覺他有精神了，人也開朗了，有時還和我母親開開玩笑。[注]訪談人：歐陽麗婷；訪談對象：云丹；訪談時間：2015年9月15日；訪談地點：青海省興海縣莫多寺。

1.5 觀察指標

每隔3 d用游標卡尺測量腫瘤長、寬徑及小鼠體重，并觀察荷瘤小鼠的行動、對外界刺激的反應及飲食情況等。計算腫瘤體積并繪制腫瘤的生長曲線。腫瘤體積計算公式：體積(mm3)=0.52×長2×寬2。在接種后第30天采用斷頸法處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎浸泡于4%多聚甲醛固定。每個腫瘤組織取一部分置于-80 ℃凍存，其余部分浸泡于4%多聚甲醛。

1.6 生存分析

為進一步了解PEDF基因修飾的間充質干細胞對LL/2荷瘤小鼠生存期的影響，取40只LL/2皮下瘤模型小鼠隨機分為四組，每組10只，分別為PBS組、Ad-PEDF組、MSC-LacZ組、MSC-PEDF組，具體給藥及治療方案完全同皮下瘤的療效研究。記錄每只小鼠的死亡時間。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 藻酸鹽包裹腫瘤細胞實驗

通過藻酸鹽包裹腫瘤細胞實驗觀察MSCs-PEDF在體內對腫瘤新生血管形成的抑制作用,結果顯示，PBS、Ad-PEDF及MSCs-LacZ組藻酸鹽珠表面有較多微血管生成，而MSCs-PEDF組則微血管明顯減少(見圖1)。FITC-Dextran攝入量檢測顯示，MSCs-PEDF組較其余3組 FITC-Dextran攝入明顯減少(P<0.01)。以上結果說明，MSCs-PEDF可抑制腫瘤細胞誘導的新生血管形成。

圖1 藻酸鹽包裹實驗觀察MSCs-PEDF抑制腫瘤誘導的新生血管形成Figure 1 The antiangiogenic activity of MSCs-PEDF by alginate-encapsulated tumor cell assay

2.2 MSCs-PEDF抑制小鼠LL/2皮下瘤生長

如圖2所示，MSCs-PEDF治療組與其余各組相比，可顯著抑制腫瘤生長(P<0.01)，MSCs-LacZ治療組與PBS組相比無顯著差異(P>0.05)。而Ad-PEDF組與PBS組比較，僅在給藥后短期內對腫瘤稍有抑制作用，而到后期則與PBS組差異不明顯(P>0.05)

2.3 MSCs-PEDF對腫瘤肺轉移的抑制作用

處死LL/2荷瘤小鼠后, 摘取各組小鼠的肺臟計算肺表面的腫瘤轉移結節數,結果顯示，MSCs-PEDF治療明顯抑制了肺轉移，與其他三組比較差異有統計學意義(P<0.05，見圖3)。Ad-PEDF組與PBS組無明顯差異(P>0.05)。

2.4 MSCs-PEDF延長LL/2荷瘤小鼠生存期

PBS治療組于接種后第42 天全部死亡，而對生存期進行Log-Rank(Mantel-Cox)分析顯示，MSCs-PEDF治療組與其余各組相比生存期明顯延長，差異有統計學意義(P<0.01，見圖4)。

2.5 觀察毒副反應

每3d測量1次小鼠體重，作為毒性反應的評估指標。在實驗過程中，MSCs-PEDF治療組與PBS組比較，荷瘤小鼠的體重變化無明顯差異(P>0.05，見圖5)。同時，各組小鼠的皮毛、食欲、行為等也無特殊改變。表明MSCs-PEDF對小鼠并不產生明顯的毒副作用。

與其余三個對照組比較，*P<0.01圖2 MSCs-PEDF對LL/2皮下瘤模型的生長抑制作用Figure 2 MSCs-PEDF inhibited growth in LL/2 subcutaneous tumor model

與其余三個對照組比較，*P<0.05圖3 不同處理后LL/2皮下瘤肺轉移結節計數Figure 3 Lung metastasis nodules number in the LL/2 subcutaneous tumor model in different groups

圖4 LL/2荷瘤小鼠生存分析Figure 4 Survival analysis of LL/2 tumor bearing mice

圖5 荷瘤小鼠體重改變情況Figure 5 Changes of body weight of tumor bearing mice

3 討論

腫瘤進展依賴于新的血管網的生成以供給其營養。非小細胞肺癌(NSCLC)是血管依賴性疾病，腫瘤血管生成在NSCLC的發生、發展及轉移過程中都發揮著重要作用。如果能有效地阻止NSCLC的血管生成，就有望控制手術或放、化療治療后腫瘤的復發和轉移[8,9]。

PEDF具有強有力的抗血管生成活性，并且還可通過促進腫瘤細胞凋亡以及誘導腫瘤細胞分化等多種途徑來抑制腫瘤細胞的生長和轉移。以上的生理特性，奠定了PEDF應用于腫瘤治療的基礎[3]。目前，已有大量的實驗研究顯示，PEDF在包括NSCLC在內多種腫瘤模型中取得了良好的效果，可顯著抑制腫瘤的生長和轉移[10]。在本研究中，攜帶PEDF基因的腺病毒(AD-PEDF)在LL/2皮下瘤的生長及轉移中相對于PBS組均表現出了強有力的抑制作用，證實了PEDF在NSCLC中具有抑瘤作用。然而，病毒或非病毒為載體的基因治療，由于缺乏靶向性，不能滲透脈管壁難以穿透至腫瘤組織。而純化的重組蛋白在體內易于降解，需要長期、反復給藥，并且因蛋白的制備、純化困難，價格較為昂貴。這些缺點大大降低了它們潛在的治療效果和應用價值[10,11]。因此，如何將PEDF基因有效地運送到腫瘤部位，并使其在局部持續表達是本實驗的研究重點。

近年來，間充質干細胞(MSCs)作為一種理想的細胞載體而被廣泛應用于腫瘤的基因治療。首先，MSCs的低免疫原性可使其在宿主體內存活數百天以上并長效表達外源基因，對慢性疾病可活的更好的治療效應；其次，MSCs具有向腫瘤組織歸巢的特性，因此，它們可以使抗腫瘤藥物在腫瘤局部達到較高的濃度，并可降低這些藥物對機體正常組織器官的副作用；最后，MSCs易于在體外分離、培養、擴增以及基因修飾，為以后的臨床應用提供了便利并且花費相對低廉[12]。已有研究證實穩定轉染并表達IFN-β的MSCs在體內對黑色素的治療效應，這是MSCs在體內作為細胞載體的第一個報道[13]。后續的大量研究也證實了MSCs與不同的治療策略相結合在抗腫瘤治療中的巨大潛力[14-16]。在本研究中，MSCs-PEDF與Ad-PEDF相比對LL/2皮下瘤具有更強的抑制作用，并且能更好地抑制腫瘤轉移，使荷瘤小鼠獲得更長的生存期。因此，MSCs是一個相對完美的運輸載體，它們可以保護PEDF基因在循環系統中不被清除，并且也不會因為在血液中濃度過高而對其他組織造成影響，同時還可促進PEDF的治療作用。MSCs-PEDF可定向遷移到腫瘤部位，而Ad-PEDF卻沒有這種能力。

本研究證實MSCs-PEDF可通過抑制腫瘤細胞誘導的新生血管形成，從而抑制LL/2腫瘤的生長和轉移，并可延長荷瘤小鼠的生存期。這些結果預示著用MSCs作為基因載體是一個很有前景的腫瘤治療策略，它改變了腺病毒載體本身固有的一些缺陷，為將來的臨床應用研究打下了基礎。本實驗研究為進展性腫瘤的靶向治療提供了一個新的策略。

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Inhibitory effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells carrying PEDF gene on Lewis lung carcinoma in mice

CHEN Qiaoling1, BAI Yiguang2, XIAO Dongqin3, LIU Kang3, FENG Gang3*

(1DepartmentofOncology,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China;2OrthopaedicDepartment,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;3ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCell,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail：lssmd18@gmail.com)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs) transfected with recombinant adenovirus encoding pigment epithelium-derived factor(Ad-PEDF) on the growth and metastasis of Lewis lung carcinoma in mice.MethodsAn alginate-encapsulated tumor cell assay was conducted to evaluate the inhibition of MSCs-PEDF on angiogenesis induced by Lewis lung carcinoma cells(LL/2).C57BL/6 mice were inoculated subcutaneously in the right flank with LL/2 cells. At 7 d after inoculation, the mice were divided into four groups(n=18 in each group). Mice were administered with 100 μl PBS, 1×108PFU Ad-PEDF, 5×105MSCs-LacZ or 5×105MSCs-PEDF in four groups by tail vein injection, respectively. Tumors were monitored every 3 d with caliper. Eight mice from each group were sacrificed at 30 d after inoculation to observe the pulmonary metastases nodules, and the rest ten mice in each group were monitored for observing the long-term survival.ResultsAlginate-encapsulated tumor cell assay exhibited that capillary network of alginate beads was apparently reduced and FITC-dextran uptake was decreased in MSCs-PEDF-treated mice compared with that in controls. The volume of subcutaneous tumors was significantly smaller in MSCs-PEDF group than in PBS group, Ad-PEDF group or MSCs-LacZ group [(1 038.8±139.0)mm3vs(2 897.7±274.9)mm3,(2 622.8±359.1)mm3, (3019.2±360.9)mm3，P<0.01). The number of pulmonary metastases nodules in MSCs-PEDF group was also less than in PBS group, Ad-PEDF group or MSCs-LacZ group(3.2±2.4vs16.0±4.0, 14.6±5.3,16.1±4.9，P<0.05), and the survival time of mice in MSCs-PEDF group was prolonged compared to the other control groups(P<0.01). Furthermore, the body weight of mice had no significant difference between MSCs-PEDF group and PBS group(P>0.05).ConclusionMSCs-PEDF may inhibit the growth and metastasis of LL/2 subcutaneous tumors, and promote the survival of tumor-bearing mice, which suggesting that MSCs engineered to secrete PEDF by adenoviral transfection may be a novel therapeutic approach for lung carcinoma.

mesenchymal stem cells； pigment epithelium-derived factor； non-small cell lung carcinoma； gene therapy

國家自然科學基金資助項目(30872614)；四川省教育廳理科重點資助項目(15ZA0216,15ZB0201)；南充市科技局科技支撐項目(14A0017,14A0022)；川北醫學院科研發展計劃項目(CBY14-A-ZD02,CBY15-A-ZD02)；四川省衛計委科研基金資助項目(16PJ202)

陳巧玲，女，1983-03生，博士，主治醫師，E-mail:cql166@163.com

2016-10-27

R734.2

A

1007-6611(2017)01-0011-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.01.003