基質濕度對黃芪幼苗防御應答及根際微生物的影響

信小娟，孫海峰，李玉成，叢建華

(大興安嶺林業集團公司農業林業科學研究院，黑龍江加格達奇165000)

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基質濕度對黃芪幼苗防御應答及根際微生物的影響

信小娟，孫海峰，李玉成，叢建華

(大興安嶺林業集團公司農業林業科學研究院，黑龍江加格達奇165000)

通過考察基質濕度對黃芪幼苗防御應答及根際微生物的影響，了解土壤水分在黃芪藥材品質形成中的可能作用。采用滲灌控水方式控制盆栽黃芪基質水分，分光光度法測定黃芪幼苗根、莖、葉綠葉揮發物(green leaf volatiles, GLVs)合成途徑關鍵酶——脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)和苯丙烷類類物質合成關鍵酶——苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase, PAL)活性和總黃酮含量，梯度稀釋法測定根際細菌和真菌數量，SPSS軟件進行數據分析。結果表明，高水分含量(81.6%)導致黃芪幼苗根際微生物數量顯著下降，葉PAL和根LOX活性顯著升高，但根中的總黃酮含量明顯低于低濕度組的。相比較而言，低濕度組黃芪根際真菌和細菌數量無明顯變化，且葉LOX活性較高?；|水分含量是影響黃芪黃酮合成與積累的重要因素，高基質濕度不利于黃芪黃酮類物質的合成與積累且很可能與根中高LOX活性有關，低基質濕度下較為穩定的根際微生物群落很可能是黃芪幼苗中黃酮類物質的合成與積累的有益因素。

黃芪；基質濕度；綠葉揮發物；異黃酮；根際微生物

黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge]為常見補益類中藥，在抗腫瘤、抗疲勞、增強免疫等方面有著廣泛的臨床應用。黃芪的品質源于其內在含有的皂苷類、黃酮類、多糖類等有效成分以及相互之間的綜合作用[1-4]，而上述有效成分的積累與黃芪藥材的生長環境有著密切的聯系。

近年來針對環境因素對于黃芪品質的影響以及對黃芪有效成分調控機制的研究已有不少研究報道[5-9]，其中涉及黃酮類成分較多，但土壤水分對黃芪品質形成及其根際微生物的影響，尚未見文獻報道。由于黃芪藥材中C6揮發物與其品質相關，所以在研究藥材品質形成中，除考慮活性物質的合成和積累外，還應考慮該類揮發物的作用[4,10]。

本研究即通過控制盆栽黃芪基質濕度，模擬黃芪生境中不同的土壤水分，研究土壤水分對黃芪幼苗綠葉揮發物合成途徑關鍵酶—脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)和苯丙烷合成途徑關鍵酶—苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase, PAL)活性、總黃酮含量和根際微生物的影響，以了解土壤水分在黃芪藥材品質形成中的可能作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃芪種子采集于山西渾源黃芪GAP基地，基源為蒙古黃芪(Astragalusmembranaceusvar.mongholicus)。暗培養箱中25℃萌發種子，萌發后移栽于不同基質濕度的營養缽中，光照培養8周，明暗周期為14h/10h，對應溫度為20℃/16℃。每組3個平行，每個平行5株植物。2周噴施液體肥料1次，間隔周噴以相同體積的自來水。整個實驗過程中嚴格控制噴施量，以保證基質水分恒定。

盆栽培養結束時，收集黃芪幼苗根、莖、葉和根際與非根際基質，植物材料液氮速凍后-80℃保存備用，根際土樣4℃保存，1周內完成后續實驗。

1.2 基質水分測定

參照《中華人民共和國藥典》(2010版)方法測定。1.3 根際微生物計數

采用梯度稀釋法，取適量稀釋液接種于LB和馬丁氏瓊脂平板中，前者于37℃培養48h，后者于28℃培養72h，進行計數。每組樣品測定3個樣本，記錄CFU數量。

1.4 LOX與PAL活性測定

參照謝道生等、趙則海等方法制備粗酶提取液，并進行酶活性測定[10-11]。

1.5 黃芪總黃酮的含量測定

參照文獻[11]進行。

1.6 數據處理與分析

每組數據均為3個平行的平均值±標準偏差，SPSS 16.0軟件進行差異顯著性分析。

2 實驗結果

2.1 基質濕度對黃芪幼苗根際微生物菌落的影響

以黃芪幼苗生長前基質為對照，對實驗結束后基質水分含量和根際微生物數量進行了計數，結果見表1。實驗分為高濕度組和低濕度組，其中低濕度組水分含量與對照間無顯著差異，而高濕度組明顯高于二者。細菌和真菌數量與水分含量變化特征一致，低濕度組根際細菌、真菌數量與對照間無顯著差異，高濕度組根際細菌和真菌數量明顯減少。簡言之，高基質濕度是影響黃芪根際微生物菌群數量的重要環境因子之一。

表1 基質濕度對黃芪幼苗根際微生物數量的影響

注：不同的字母表示組間存在顯著性差異，P<0.05；表2～4同。

2.2 基質濕度對黃芪幼苗LOX的影響

黃芪幼苗根、莖、葉LOX活性測定結果見表2。從該表可以看出，基質濕度對黃芪幼苗LOX活性的影響主要體現在葉片和根，對莖影響較小，高濕度與低濕度組莖LOX無顯著差異。在葉片中，高基質濕度導致LOX活性顯著降低。而在根中，基質高水分含量引起根LOX活性的顯著升高。該結果表明，黃芪幼苗地上和地下部分對土壤水分的響應存在明顯差異。相同濕度組黃芪幼苗不同部位LOX活性的t-檢驗結果表明，高濕度組幼苗不同部位LOX活性無顯著差異，而低濕度組莖葉間存在顯著差異。換言之，土壤水分含量低時，黃芪莖葉C6揮發物合成響應存在差異，葉片C6揮發物合成途徑關鍵酶LOX活性顯著增加。

表2 基質濕度對黃芪幼苗

2.3 基質濕度對黃芪幼苗PAL活性的影響

已有研究表明，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是黃芪黃酮類物質合成的關鍵酶，在該類物質合成與積累中起著關鍵作用[12]。黃芪幼苗不同部位PAL測定結果見表4。從該表可以看出，PAL在黃芪幼苗根和莖中較為穩定，2組數據間無顯著差異。但是，PAL活性在葉片組織中明顯不同，基質高濕度導致葉片PAL活性顯著升高，即由基質濕度引起的黃芪幼苗苯丙烷代謝途徑主要響應部位為葉片，明顯有別于GLVs合成途徑的主要響應部位。具體而言，高濕度基質有助于黃芪葉片PAL活性升高。不同部位間PAL活性t-檢驗結果表明，高濕度組莖葉PAL活性無顯著差異，但二者與根存在顯著差異。低濕度組中，根、莖、葉三者間PAL活性均存在顯著差異，特別是葉與莖、根之間差異極顯著，莖葉組織中活性遠高于根。換言之，無論基質濕度高低，黃芪幼苗中的主要響應部位均為地上莖葉，特別是葉片，響應最高。

表3 基質濕度對黃芪幼苗不同部位

2.4 基質濕度對黃芪幼苗總黃酮積累的影響

從表4可見，基質濕度對黃芪幼苗莖葉總黃酮含量影響較小，高、低濕度組間莖葉含量均無顯著差異。但是，基質濕度顯著影響著根中總黃酮含量，低基質濕度組總黃酮含量顯著高于低濕度組，即低基質濕度有利于黃酮類物質在根中的積累。相同濕度組內不同部位t-檢驗結果表明，高濕度組黃芪幼苗葉與莖、葉與根之間存在顯著差異，與PAL活性分析結果正好相反。

表4 基質濕度對黃芪幼苗

綜上所述，基質濕度影響著黃芪防御應答。較低的基質濕度對黃芪黃酮合成的關鍵酶PAL活性和總黃酮積累影響更大，且響應部位主要為根。

3 討論

趙則海等通過比較攀援型和矮生型四棱豆苯丙氨酸解氨酶活性和黃酮含量發現，PAL活性均為種子最高，嫩豆莢最低；總黃酮含量均為葉最高，儲藏器官塊根最低[13]。黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)是我國名貴中藥關黃柏的藥源植物，黃檗生物堿是其主要藥效成分。李霞等發現，輕度干旱有利于黃檗根莖外皮中生物堿的合成與積累，水澇處理則導致幼苗生物堿的含量顯著降低[14]。在抗旱性不同的甘蔗中，10%聚乙二醇脅迫2h～14h，幼苗葉片中PAL活性均呈現先降低后升高的變化規律，但類黃酮含量在抗旱性強的品種中降低，而在抗旱性弱的品種中先降低后升高[15]。本研究中，無論是低濕度條件下生長的黃芪幼苗、還是高濕度條件下的黃芪幼苗，葉片中總黃酮含量均較高，但低基質濕度促進了藥用部位根中黃酮類物質的積累。但PAL活性變化與總黃酮積累并不一致，在高濕度組幼苗葉片中活性最高。

在本研究中，高基質濕度導致黃芪幼苗根際可培養微生物數量減少，即引起根際菌群的明顯改變，同時伴隨著根LOX活性的顯著增加。同時，低濕度組菌群可培養微生物數量與對照間無顯著差異，并伴隨著總黃酮積累的增加。該結果是不是意味著土壤水分在維系黃芪根際微生物平衡中發揮著重要作用，穩定的根際微生態在藥材品質形成中發揮著重要作用。為了解釋該問題，我們有必要從環境因子影響根際微生物與植物互作的角度，從多個層次研究藥用植物黃芪中黃酮類物質積累機制。

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Effects of Matrix Moisture on Defense Response and Rhizosphere Microbial Communities ofAstragalusmembranaceusvar.mongholicusSeedlings

Xin Xiaojuan，Sun Haifeng，Li Yucheng，Cong Jianhua

(Forest Group Company of Agroforestry Sciences Academy of Daxing anling,Jiagedaqi,Heilongjiang 165000)

To find out potential role of soil water on quality formation of Astragali Radix by exploring effects of matrix moisture on defense response and rhizosphere microbial communities ofAstragalusmembranaceusvar.monghoseedlings. The matrix moisture was controlled by the method of root-sphere osmotic irrigation, isoflavone content and activities of lipoxygenase (LOX) and phenylalanin ammonia-lyase (PAL) involved in the biosynthese of green leaf volatiles (GLVs) and isoflavones respectively, were determined by spectrophotometry; colony forming units (CFU) of rhizosphere bacteria and fungi were counted by gradient dilution method, resulting data was analyzed by SPSS software. Results: Higher matrix moisture (81.6%) not only resulted in significant decrease in both rhizosphere bacterial and fungal CFUs and significant increase in leaf PAL and root LOX activities but lead to lower isoflavone content in roots. Comparatively, lower matrix moisture resulted in higher leaf LOX activities and relatively steady rhizosphere microbial communities and their CFUs were at the same level to the ones before planting. Matrix moisture affected the biosynthesis and accumulation of isoflavone compounds, and higher moisture adverse to the process, which might be caused by higher root LOX activity. Steady rhizosphere microbial communities in lower moisture level might benefit to the biosynthesis and accumulation of isoflavones.

Astragalusmembranaceusvar.mongholicusSeedlings; Matrix moisture; Green leaf volatiles; Isoflavone; Rhizosphere microbiota

2016-10-28

信小娟(1967-)，女，高級工程師，從事中草藥種植研究，E-mail:Xinxiaojuan323@163.com； *通訊作者：孫海峰，副教授，從事中藥質量評價與品質形成研究, E-mail:haifeng@sxu.edu.cn。

S567.23

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.01.003