白芍總苷對Nc/Nga小鼠特應性皮炎的保護作用

劉 斌 李 靜 胡惠清 朱 里

·論著·

白芍總苷對Nc/Nga小鼠特應性皮炎的保護作用

劉 斌1李 靜1胡惠清1朱 里2

目的： 確定白芍總苷(Total Glucosides of Paeony,TGP)對小鼠特應性皮炎的保護作用。方法： 利用2,4-二硝基氯苯(DNCB)建立Nc/Nga小鼠實驗性特應性皮炎模型。30只小鼠分為3組：正常對照組，模型組，實驗組(TGP治療)，每組10只。實驗組連續灌胃用藥2周，分別于第8 d、15 d測量各組小鼠背部皮損厚度和皮膚質量，并利用ELISA法分別檢測第8 d、15 d血清中細胞因子IFN-γ，IL-4,IL-5和IgE的表達。結果： 白芍總苷治療第8 d、15 d，皮損厚度變薄及皮損皮膚質量明顯減小(P<0.05)，血清細胞因子IL-4、IL-5和IgE水平明顯低于模型組，IFN-γ水平明顯高于模型組(P<0.05)。結論： 白芍總苷可能通過促進IFN-γ分泌，下調炎癥因子IL-4、IL-5水平以及抑制IgE表達從而對小鼠特應性皮炎產生保護作用。

白芍總苷； 特應性皮炎； 細胞因子； 小鼠

特應性皮炎(Atopic Dermatitis, AD)的病因尚未明確，可能與吸入性過敏原刺激、自身抗原、遺傳易感性、感染及皮膚功能下降等有關[1,2]。中藥治療AD具有獨特療效[3,4]，白芍總苷(Total Glucosides of Paeon, TGP) 是傳統中藥白芍根的主要有效成分，具有調節免疫平衡，抗炎及抗免疫學疾病的功效[5,6]。研究發現，TGP在小鼠糖尿病腎損傷、類風濕性關節炎以及強制性脊柱炎等疾病中具有有效抑制炎性反應的作用[7-9]。為探索TGP對于特應性皮炎中炎癥反應的影響，本實驗采用Nc/Nga小鼠作為特應性皮炎的模型，以觀察白芍總苷對Nc/Nga小鼠特應性皮炎皮膚情況以及血漿細胞因子的影響，旨在為探索白芍總苷對特應性皮炎的影響以及相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 6周齡健康、清潔SPF級Nc/Nga小鼠30只(武漢大學醫學院動物實驗中心)，雄性，體質量25～30 g。適應性飼養1周，各組小鼠分籠飼養。白芍總苷(Sigma公司，美國)；干擾素γ (IFN-γ)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、小鼠免疫球蛋白E(IgE)酶聯免疫檢測試劑盒(Invitrogen公司，美國)；2，4-二硝基氯苯(DNCB)(Wako，日本)。

1.2 方法

1.2.1 特應性皮炎動物模型建立和給藥各組小鼠在清潔級動物實驗室適應性飼養1周后進入實驗。剔除小鼠背部面積約3 cm×3 cm皮膚，并于暴露皮膚處涂100 μL 1% 2，4-DNCB進行誘導。1周后于背部剃毛處外涂50 μL 0.1% DNFB進行激發，每周2次，誘發皮炎。于用藥后第8天再次給予50 μL 0.5% 2,4-DNCB激發1次[10]。小鼠皮膚出現紅斑、鱗屑、結痂等視為造模成功，造模成功24 h后實驗組開始灌胃給予白芍總苷，每天給藥1次，按體重每次1 mL/100 g灌胃，共給藥14 d，模型組和空白對照組給予等體積生理鹽水處理(圖1)。

1.2.2 皮膚質量和皮膚厚度的測定在造模后第8 d和第15 d，用10 mm打孔器選取小鼠背部皮膚3個非重復部位打孔，用電子稱測量質量，各組皮膚質量取平均值；皮膚厚度：第8天和第15天，打孔方法相同，小鼠背部皮膚厚度(mm)利用皮膚測微儀測量，各組皮膚厚度取平均值。

1.2.3 IFN-γ、IL-4、IL-5以及IgE含量檢測分別于第8 d和15 d取小鼠眼眶靜脈血，抗凝血在4℃下2000×g離心30 min后凍存于-20℃冰箱待測，Elisa法檢測血漿中IFN-γ、IL-4、IL-5以及IgE水平。

2 結果

2.1 各組小鼠皮膚情況造模后，模型組小鼠皮膚出現紅斑及血性滲出，并出現散在出血點和黃色斑塊，經白芍總苷治療8天后，實驗組小鼠皮膚紅斑及滲出基本消失，并出現黃色厚薄不一的痂皮，治療15天后痂皮基本脫落并長出新發(圖1)。

圖1 造模后第8 d 、15 d各組大鼠皮膚外觀

2.2 白芍總苷對小鼠皮膚質量的影響造模成功后第8 d和15 d：模型組小鼠背部皮損處皮膚質量分別為(58.4±1.9)mg和(49.5±2.1)mg，正常對照組為(29.7±1.9)mg和(30.8±2.1)mg。兩組比較，模型組皮損皮膚質量明顯增多(P<0.05)，而用藥后實驗組小鼠背部皮損皮膚質量分別為(44.9±1.9)mg和(36.5±1.8)mg，較模型組明顯降低(P<0.05)。

2.3 白芍總苷對小鼠皮膚厚度的影響造模成功后第8 d和15 d：模型組小鼠背部皮損皮膚厚度為(805.3±38.4)μm和(609.5±33.7)μm，正常對照組為(381.7±29.3)μm和(378.4±28.1)μm。兩組比較，模型組小鼠皮膚厚度明顯增加(P<0.05)。用藥后實驗組小鼠背部皮損皮膚厚度為(549.9±30.5)μm和(481.6±30.8)μm，較模型組明顯降低(P<0.05)。

2.4 白芍總苷對小鼠血漿IFN-γ、IL-4 、IL-5、IgE水平的影響造模后第8 d、15 d：模型組血漿細胞因子IFN-γ含量下調，用藥后實驗組IFN-γ含量上調，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；細胞因子IL-4 、IL-5、IgE含量增高，用藥后含量均降低，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 造模后第8 d 和15 d白芍總苷對小鼠血漿IFN-γ、IL-4 、IL-5、IgE水平的影響

注：*P<0.05,與正常組比較；#P<0.05,與模型組比較

3 討論

免疫功能異常是引發AD的重要機制之一，研究證實，在AD患者體內血漿免疫球蛋白E(IgE)和Th2型細胞因子水平均明顯提高[11]。眾所周知，Th1和Th2細胞因子之間相互拮抗，而IFN-γ是Th1群細胞主要分泌的細胞因子之一， IL-4和IL-5則是Th2群細胞主要分泌的細胞因子之一， Th1/Th2之間保持平衡對于機體免疫功能具有重要意義，Th1/Th2的平衡失調可導致一系列疾病，如過敏性疾病，免疫失調等[12,13]。而實驗所研究的特應性皮炎主要是Th2誘導的過敏性疾病，Th2分泌的IL-4及IL-5可促使淋巴B細胞產生IgE，而Th1分泌的IFN-γ則可明顯抑制IgE的合成和發展，特應性皮炎小鼠皮損的嚴重程度與IgE水平相關[14]。Sugiura等[15]通過研究發現，特應性皮炎Nc/Nga小鼠皮損中分泌IL-4和IL-5的細胞明顯增多，并且隨周齡增長而增加。研究發現IL-12在免疫反應中誘導IFN-γ表達，抑制IL-4和IL-5，從而誘導機體免疫反應朝著Th1型方向發展[16]。IFN-γ可抑制Th2類細胞因子IL-4和IL-5的分泌，抑制其向Th2分化，促使免疫反應向Th1分化，并可阻斷IgE的合成，下調嗜酸粒細胞的表達和浸潤，以減輕特應性皮炎的發生和發展[17,18]。因此，降低AD患者IgE表達水平、抑制Th2型細胞因子的分泌，抑制Th2型免疫反應，使之朝著Th1方向發展，有望成為AD治療的關鍵靶點。

在本實驗中，模型組小鼠首次DNCB刺激后，小鼠背部出現鱗屑、紅斑等現象，第2次刺激后，小鼠背部紅斑、鱗屑加重，第3次刺激后，小鼠背部嚴重紅斑及厚痂形成。實驗組在用藥第8天及第15天均明顯減輕AD皮膚質量和皮膚厚度。實驗組在用藥第8天及第15天，血清IL-4、IL-5以及IgE水平顯著低于模型組，IFN-γ含量明顯高于模型組，提示白芍總苷對AD作用機制至少是通過抑制小鼠皮損和血清中Th2類細胞因子水平，提高Th1類細胞因子表達，調節Th1和Th2平衡從而起抑制特應性皮炎的作用。

本實驗研究證實，白芍總苷對小鼠特應性皮炎具有抑制作用，可通過上調Th1分泌的IFN-γ，抑制Th2分泌的IL-4、IL-5，進而抑制IgE合成和表達，調節Th1/Th2平衡從而對特應性皮炎產生一定的治療作用，這為臨床特異性皮炎治療的研究提供了新的方向。

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(收稿：2016-05-03 修回：2016-08-27)

Effect of the total glucosides of paeony on experimental atopic dermatitis in mice

LIUBin1,LIJing1,HUHuiqing1,ZHULi2.

1.DepartmentofDermatology,TheNinthHospitalofWuhanCity,Wuhan430080,China; 2.DepartmentofDermatology,HuaZhongUniversityofScienceandTechnology,UnionHospitaloftongjiMedicalCollege，Wuhan430030,China

ZHULi,E-mail:wqlb3344@163.com

Objective: To determine the effect of total glucosides of paeony (TGP) on atopic dermatitis in mice. Methods: An atopic dermatitis model was established on the back of NC/Nga mice with DNCB. Thirty mice were divided into 3 groups: control group, model group and TGP group (10 mice in each group). The mice of TGP group were treated by TGP for 14 days. The levels of serum cytokines including IL-4 and IL-5, IFN-γ and IgE were detected with ELISA kit at day 8th and 15th. Results: TGP could significantly decrease the skin thickness and weightness at 8 days and 15 days (P<0.05). The levels of IL-4,IL-5 and IgE were significantly decreased , while the level of IFN-γ was increased in TGP group, compared with other groups. Conclusion: TGP has protective effects on atopic dermatitis in mice, which may be through inhibiting production of IgE, IL-4 and IL-5, and promoting the secretion of IFN-γ.

total glucosides of paeony; atopic dermatitis; cytokines; mice

1武漢市第九醫院皮膚科,430080 2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院皮膚科,武漢，430030

朱里，E-mail: wqlb3344@163.com