白癜風免疫微環境對黑素細胞CXCL10表達的影響

李博為 李舒麗 楊鈺琪 張偉剛 劉 玲 高天文 李春英

·論著·

白癜風免疫微環境對黑素細胞CXCL10表達的影響

李博為 李舒麗 楊鈺琪 張偉剛 劉 玲 高天文 李春英

目的： 明確白癜風免疫微環境對黑素細胞CXCL10表達的影響。方法： 采用qRT-PCR檢測進展期白癜風患者皮損組織中的細胞因子；采用qRT-PCR及ELISA檢測白癜風免疫微環境中上調的細胞因子對黑素細胞系PIG1 CXCL10表達和分泌。結果： 進展期白癜風患者皮損組織中IFN-γ、TNF-α和IL-1β mRNA表達上調；三者聯合刺激顯著上調PIG1細胞CXCL10 mRNA的表達以及蛋白分泌，并呈現時間依賴性。結論： 白癜風局部免疫微環境促進黑素細胞表達及分泌CXCL10，可能參與白癜風發病。

白癜風； 免疫微環境； 黑素細胞； 趨化因子CXC配體10

白癜風是一種局部或廣泛的黑素細胞被破壞的色素脫失性疾病，目前關于其致病機理尚不明確。現有研究表明，自身免疫在白癜風發病中扮演重要角色，白癜風患者體內存在免疫細胞異常活化、自身抗體大量產生[1]。趨化因子是能夠吸引白細胞遷移的一類低分子量蛋白質，在免疫反應中具有關鍵作用，趨化因子CXC配體10(chemokine C-X-C motif ligand 10，CXCL10)是其中重要的一員。現有研究表明，白癜風患者血清高表達CXCL10，其可能參與白癜風發病和進展[2]。然而，黑素細胞是否具有合成分泌CXCL10的功能尚未見報道。本研究旨在離體細胞水平研究白癜風免疫微環境對黑素細胞CXCL10表達和分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 酶標儀、PCR擴增儀和熒光定量PCR儀為美國BIO-RAD公司生產。人永生化黑素細胞系PIG1由美國芝加哥大學Caroline Le Poole教授饋贈，254培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司，總RNA提取試劑盒購于安美生物科技公司，反轉錄cDNA試劑盒和SYBR Premix Ex Taq II kit購于大連Takara公司，PCR引物由大連Takara公司設計并合成，重組人IFN-γ、TNF-α和IL-1β刺激因子購于Cell Signaling Technology公司，CXCL10 ELISA檢測試劑盒購于美國RD公司。

1.2 方法

1.2.1 皮膚組織樣本處理 白癜風患者皮損組織來源于我科皮膚病理中心，6例進展期患者的診斷符合2003年中西醫結合學會皮膚病專業委員會色素病組頒布的白癜風臨床診斷分型標準修訂版[3]。6例正常皮膚樣本來源于同期接受美容手術患者的非曝光部位，且均無自身免疫性疾病及家族史。兩組樣本性別匹配，年齡無統計學差異。標本取材均經患者及志愿者知情同意并經過第四軍醫大學西京醫院倫理委員會批準。正常皮膚和白癜風患者皮損組織樣本從液氮罐取出，各取表皮面積相等的50 mg全層皮片于滅菌研缽中磨碎，呈粉末狀后加入1 mL Trizol在冰上裂解組織，提取總RNA。

1.2.2 細胞培養及處理 PIG1細胞用含5% FBS的254培養基于37℃、5% CO2條件下培養。將PIG1細胞接種于6孔板，分為4個處理組，即單獨刺激3組和聯合刺激1組，血清饑餓16 h后，分別予以IFN-γ(10 ng/mL)、TNF-α(10 ng/mL)、IL-1β(10 ng/mL)、IFN-γ+TNF-α+IL-1β聯合刺激24 h后收集細胞和上清；另外，聯合刺激組進行時間梯度實驗，在處理后12、24、48和72 h收集細胞和上清，分別檢測CXCL10 mRNA表達及蛋白分泌水平。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞因子mRNA表達 所有皮膚組織和經過不同細胞因子刺激后的細胞用Trizol試劑提取總RNA后，嚴格按照反轉錄cDNA試劑盒說明書進行操作，采用qRT-PCR檢測IFN-γ、TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及CXCL10的mRNA水平，實驗所用特異引物序列詳見表1。

表1 RT-PCR實驗所用引物序列

1.2.4 ELISA檢測CXCL10分泌 收集不同刺激處理預定時間的細胞上清，按照ELISA檢測試劑盒操作說明配制好所用試劑，進行加樣、加工作液、37℃孵育、加底物溶液和終止溶液后，即刻用酶標儀在450 nm讀取數值并分析數據。

1.2.5 統計學方法 所有實驗均進行至少3次獨立重復，實驗結果采用Graphpad Prism 5統計軟件進行分析，采用student-t檢驗進行統計，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 進展期白癜風患者皮損組織局部細胞因子mRNA表達情況 提取健康人和進展期白癜風患者皮損組織RNA后采用qRT-PCR檢測多種相關細胞因子mRNA表達變化。結果顯示，進展期白癜風患者皮損組織中IFN-γ、TNF-α和IL-1β mRNA表達水平顯著升高，而TGF-β、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23 mRNA表達情況在進展期白癜風患者皮損和健康人之間沒有顯著差異(圖1)，表明進展期白癜風患者皮損組織浸潤的炎癥因子以IFN-γ、TNF-α及IL-1β為主，而非Th17型細胞因子。

圖1 進展期白癜風患者皮損組織局部細胞因子mRNA表達情況(**P<0.01，***P<0.001)

2.2 細胞因子誘導PIG1細胞CXCL10 mRNA的表達情況 通過上述上調的細胞因子刺激PIG1細胞，發現IL-1β單獨刺激并不能上調PIG1細胞CXCL10 mRNA的表達，TNF-α輕度上調CXCL10 mRNA，但無顯著差異，而IFN-γ及其與TNF-α、IL-1β聯合能顯著上調PIG1細胞CXCL10 mRNA表達(圖2a)。且三者聯合處理可以時間依賴方式增加PIG1細胞CXCL10 mRNA的表達(圖2b)。

2.3 細胞因子誘導PIG1細胞CXCL10的分泌情況 本實驗檢測了篩選出的三種細胞因子對PIG1細胞CXCL10的分泌情況。結果顯示，IFN-γ和TNF-α單獨刺激或者三者聯合刺激均能顯著促進CXCL10分泌，但是IL-1β的單獨刺激仍然不能誘導其分泌(圖3a)。此外，我們檢測三種細胞因子聯合處理不同時間后CXCL10的分泌，發現三者聯合處理同樣以時間依賴方式增加PIG1細胞CXCL10分泌(圖3b)。以上結果提示，和CXCL10 mRNA上調一致，白癜風患者皮損免疫微環境的異常促進黑素細胞分泌CXCL10。

圖2 2a：細胞因子單刺激和聯合刺激PIG1細胞24 h后CXCL10 mRNA的表達情況(***P<0.001)；2b：IFN-γ，TNF-α及IL-1β聯合刺激PIG1細胞不同時間后CXCL10 mRNA的表達情況(*P<0.05，***P<0.001)

圖3 3a：細胞因子單刺激和聯合刺激PIG1細胞24 h后CXCL10的分泌情況(*P<0.05，***P<0.001)；3b：IFN-γ，TNF-α及IL-1β聯合刺激PIG1細胞不同時間后CXCL10的分泌情況(**P<0.01，***P<0.001)

3 討論

白癜風是一種常見的色素脫失性疾病，以表皮黑素細胞被破壞導致皮膚黏膜白斑為特征。黑素細胞被破壞的機制迄今尚未完全闡明，但比較公認的是，T細胞免疫應答是導致表皮黑素細胞免疫損傷的主要原因[4，5]。研究發現，白癜風患者的外周血中CD4+和CD8+T細胞的數量及比例發生變化[6]，且白癜風患者皮損有大量促炎細胞因子及CD8+T細胞浸潤，最終導致黑素細胞免疫損傷。我們通過檢測白癜風患者皮損局部細胞因子表達，發現白癜風皮損以Th1型細胞因子IFN-γ為主，其次為促炎因子TNF-α及IL-1β，而Th17型細胞因子均無明顯升高。這為應用于銀屑病患者的以拮抗Th17型細胞因子的生物制劑并不能有效緩解白癜風病情提供了合理解釋，表明白癜風與銀屑病患者存在不同的致病細胞因子表達譜。van den Boorn等[7]之前分離白癜風皮損CD8+T細胞，發現這些CD8+T細胞在抗原刺激活化后，可分泌較多的IFN-γ及TNF-α，認為活化的CD8+T細胞是這些細胞因子的主要來源。

最近大量研究證實，IFN-γ、TNF-α及IL-1β均可誘導多種細胞分泌趨化因子促使T細胞向外周組織定向遷移。有學者報道，白癜風患者皮損高表達IFN-γ誘導型的Th1趨化因子CXCL10，伴隨高表達其受體CXCR3的CD8+T細胞浸潤；并在小鼠模型中證實CXCL10驅動黑素細胞特異的CD8+T細胞向皮損處定向遷移，介導黑素細胞損傷；此外，使用CXCL10中和抗體可以阻止色素脫失并促進白癜風小鼠復色[2]。近期，我國項蕾紅研究團隊通過臨床樣本研究證實，白癜風患者血清中高表達CXCL10，與VASI(Vitiligo Area Scoring Index)評分正相關，而且進展期白癜風患者治療后其血清CXCL10水平降低[8]。因此，闡明CXCL10的表達機制對理解白癜風的發病進展及治療策略選擇，均具有重要意義。以往研究發現，CXCL10可由角質形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等分泌[9，10]。黑素細胞是否分泌CXCL10尚不清楚。我們的研究首次發現，IFN-γ、TNF-α及IL-1β均可誘導黑素細胞分泌CXCL10，且以三者聯合效果最為顯著。此外，我們注意到TNF-α單獨刺激24 h黑素細胞顯著促進CXCL10分泌，但其mRNA水平僅輕度上調無顯著差異。Harris等[11]研究發現，TNF-α處理3 h后CXCL10 mRNA水平顯著上調，8 h后降至與對照組無差異；而ELISA檢測發現8 h時CXCL10分泌明顯高于對照組，表明TNF-α刺激后，CXCL10 mRNA與蛋白水平并不完全一致，這一現象為我們的研究提供了一定的解釋。

綜合我們的研究及國內外進展，我們提出，白癜風皮損局部浸潤的CD8+T細胞活化后可分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，形成局部免疫微環境，可誘導黑素細胞分泌CXCL10，借此募集表達其受體CXCR3的CD8+T細胞遷移至皮損，進一步促進IFN-γ、TNF-α等的分泌，形成正反饋環路，放大白癜風皮損局部免疫反應。

綜上，我們明確了白癜風皮損以IFN-γ、TNF-α及IL-1β顯著上調的免疫微環境，進一步在體外證實這些細胞因子可誘導黑素細胞合成并分泌趨化因子CXCL10，促進白癜風局部T細胞免疫應答，參與白癜風發病及進展。

[1] Laddha NC, Dwivedi M, Mansuri MS, et al. Role of oxidative stress and autoimmunity in onset and progression of vitiligo[J]. Exp Dermatol,2014,23(5):352-353.

[2] Rashighi M, Aqarwal P, Richmond JM, et al. CXCL10 is critical for the progression and maintenance of depigmentation in a mouse model of vitiligo[J]. Sci Transl Med,2014,6(223):223ra23.

[3] 中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會色素病學組.白癜風臨床分型及療效標準(2003年修訂稿)[J].中華皮膚科雜志,2004,37(7):440.

[4] Zhang Y, Liu L, Jin L, et al. Oxidative stress-induced calreticulin expression and translocation: new insights into the destruction of melanocytes[J]. J Invest Dermatol,2014,134(1):183-191.

[5] Richmond JM, Frisoli ML, Harris JE. Innate immune mechanisms in vitiligo: danger from within[J]. Curr Opin Immunol,2013,25(6):676-682.

[6] Dwivedi M, Laddha NC, Arora P, et al. Decreased regulatory T-cells and CD4(+)/CD8(+) ratio correlate with disease onset and progression in patients with generalized vitiligo[J]. Pigment Cell Melanoma Res,2013,26(4):586-591.

[7] van den Boorn JG, Konijnenberg D, Dellemijn TA, et al. Autoimmune destruction of skin melanocytes by perilesional T cells from vitiligo patients[J]. J Invest Dermatol,2009,129(9):2220-2232.

[8] Wang XX, Wang QQ, Wu JQ, et al. Increased expression of CXCR3 and its ligands in patients with vitiligo and CXCL10 as a potential clinical marker for vitiligo[J]. Br J Dermatol,2016,174(6):1318-1326.

[9] Antonelli A, Ferrari SM, Giuggioli D, et al. Chemokine (C-X-C motif) ligand (CXCL) 10 in autoimmune diseases[J]. Autoimmun Rev,2014,13(3):272-280.

[10] Groom JR, Lauster AD. CXCR3 ligands: redundant, collaborative and antagonistic functions[J]. Immnol Cell Biol,2011,89(2):207-215.

[11] Harris DP, Bandyopadhyay S, Maxwell TJ, et al. Tumor necrosis factor (TNF)-α induction of CXCL10 in endothelial cells requires protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5)-mediated nuclear factor (NF)-κB p65 methylation[J]. J Biol Chem,2014,289(22):15328-15339.

(收稿：2016-09-07 修回：2016-09-27)

Effects of immune microenvironment on the expression of CXCL10 in melanocytes of vitiligo

LIBowei,LIShuli,YANGYuqi,ZHANGWeigang,LIULing,GAOTianwen,LIChunying.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the effects of immune microenvironment on the expression of CXCL10 in melanocytes of vitiligo. Methods: Quantitative Real-Time PCR was performed to detect the expression of cytokines in skin lesions from progressive vitiligo patients. And then, a melanocyte cell line-PIG1 was stimulated by the cytokines that were up-regulated in vitiligo lesions and to measure the expression and secretion of CXCL10 in PIG1 cells. Results: The mRNA level of IFN-γ, TNF-α and IL-1β were up-regulated in the skin lesions of progressive vitiligo patients. When a combined stimulation with the three cytokines, the expression and secretion of CXCL10 in PIG1 cells were up-regulated significantly, in a time-dependent manner. Conclusion: Immune microenvironment in vitiligo can promote the expression and secretion of CXCL10 in melanocytes, which may contribute to the onset of vitiligo.

vitiligo; immune microenvironment; melanocytes; CXCL10

國家自然科學基金資助項目(編號:81602764, 81472893)

第四軍醫大學西京皮膚醫院，陜西西安，710032

李春英，E-mail: lichying@fmmu.edu.cn