安子合劑對抗磷脂抗體陽性流產小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響Δ

柳 靜，陸啟濱（南京中醫藥大學附屬醫院婦科，南京 210029）

安子合劑對抗磷脂抗體陽性流產小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響Δ

柳 靜＊，陸啟濱#（南京中醫藥大學附屬醫院婦科，南京 210029）

目的：研究安子合劑對抗磷脂抗體（APA）陽性流產小鼠Toll樣受體4（TLR4）/髓樣分化因子88（MyD88）/核因子κB（NF-κB）信號通路的影響，探討其抗APA陽性流產作用機制。方法：將BALB/c小鼠（♀）隨機分為空白對照組、模型組、阿司匹林組（陽性對照，0.019 5 g/kg）和安子合劑低、中、高劑量組（37.7、75.4、150.8 g/kg，以生藥計），每組10只。除空白對照組外，其余各組小鼠均以人β2-糖蛋白Ⅰ為誘導劑建立APA陽性流產模型。從妊娠第1天起，各給藥組小鼠ig相應藥物，空白對照組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續9 d。分別采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法和免疫組化法測定胎盤組織TLR4、髓樣分化蛋白2（MD2）、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達水平。結果：與空白對照組比較，模型組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，阿司匹林組和安子合劑低、中劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88 mRNA及其蛋白表達水平，安子合劑高劑量組小鼠胎盤組織TLR4蛋白表達水平，以及各給藥組小鼠胎盤組織NF-κB蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；安子合劑低劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2 mRNA表達水平和MD2、MyD88蛋白表達水平較阿司匹林組更低（P＜0.05或P＜0.01）。結論：安子合劑可抑制APA陽性流產小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路轉導，這可能是其抗APA陽性流產的作用機制之一。

安子合劑；抗磷脂抗體；TLR4/MyD88/NF-κB信號通路；流產小鼠；胎盤組織

抗磷脂抗體（Antiphospholipid antibody，APA）陽性流產是自身免疫流產中最為常見的一種，可引起復發性流產以及嚴重的產科并發癥（如早產、宮內生長遲緩或胎盤機能不全等），危害女性生殖健康[1]。APA包括抗心磷脂抗體（Anticardiolipin antibody，ACA）、抗β2-糖蛋白Ⅰ抗體（Anti-β2-glycoproteinⅠantibody）和狼瘡抗凝物（Lupus anticoagulant），其中抗β2-糖蛋白Ⅰ被認為是妊娠丟失的獨立危險因素。研究發現抗β2-糖蛋白Ⅰ可與其抗原結合形成復合物，活化Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），引起髓樣分化蛋白2（Myeloid differentiation-2，MD2）的分泌，啟動髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）進行細胞內信號轉導，最終激活核因子κB（Nuclear factor-κB，NF-κB），誘導內皮細胞活化，釋放血栓及炎癥相關細胞因子，導致妊娠排斥和丟失。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路轉導異常成為APA陽性流產機制研究中新的研究熱點[2]。

中醫安胎法源遠流長，是中醫婦科學中頗有優勢和特色的治法之一。南京中醫藥大學附屬醫院婦科研制的安子合劑由續斷、桑寄生、菟絲子、苧麻根、丹參、黃芩、白術、太子參、甘草等12種中藥材組成，具有補腎健脾、清熱活血的功效，其自1999年成為院內制劑以來，臨床應用的保胎成功率達90.0%[3]。前期研究表明，安子合劑具有降低孕鼠外周血ACA滴度、調節免疫功能、影響細胞增殖等作用[4-6]，但其作用靶點尚不十分明確。本研究在前期工作及相關文獻報道[4-6]的基礎上，以人β2-糖蛋白Ⅰ為免疫原建立APA陽性流產小鼠模型，探討安子合劑對模型小鼠胎盤組織TLR4/MyD88/NF-κB信號轉導通路中關鍵分子的影響，旨在從免疫炎癥角度揭示其抗APA陽性流產的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

DX-45光學顯微鏡（日本Olympus公司）；Mikro 200R冷凍離心機（德國Hettich公司）；Nanodrop 2000核酸定量儀（美國Thermo公司）；Veriti@96 Well Thermal Cycler實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）系統（美國ABI公司）。

1.2 藥品與試劑

安子合劑（南京中醫藥大學附屬醫院制劑部自制，批號：1308002，規格：250 mL/瓶，其中含原藥材0.58 g/mL）；阿司匹林腸溶片（石藥集團歐意藥業有限公司，批號：018140883，規格：每片25 mg）；人β2-糖蛋白Ⅰ（以色列ProSpec公司，批號：PRO-388，純度：＞98%）；弗氏完全佐劑（CFA）、弗氏不完全佐劑（IFA）購自美國Sigma公司；反轉錄試劑盒、Trizol試劑（日本Takara公司，批號：A4537、AA2103-1）；TLR4、MD2抗體（英國Abcam公司，批號：ab13556、ab73550）；MyD88、NF-κB抗體（美國CST公司，批號：4283S、8242P）；TLR4、MD2、MyD88、NF-κB引物均由南京金斯瑞公司合成；TLR4、MD2、MyD88、NF-κB免疫組化試劑盒（美國Bio-world公司，批號：20317592-1、203106740-1、20300164-1、20300068-1）。

1.3 動物

SPF級健康BALB/c小鼠90只[♀：60只，8周齡，體質量（25±2）g；♂：30只，8～10周齡，體質量（25±2）g]，均購自常州卡文斯實驗動物有限公司，動物許可證號為SCXK（蘇）2011-0003，合格證號為201401513。采用SPF級小鼠標準全營養飼料飼養。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只BALB/c小鼠（♀）隨機為6組，每組10只，分別為空白對照組、模型組、阿司匹林組（陽性對照，0.019 5 g/mL）[5-6]和安子合劑低、中、高劑量組（以生藥計給藥劑量分別為37.7、75.4、150.8 g/mL，按成人臨床劑量的1、2、4倍劑量換算而得）。除空白對照組外，其余各組小鼠參照文獻[7-8]中方法以人β2-糖蛋白Ⅰ為免疫原建立APA陽性流產小鼠模型：將β2-糖蛋白Ⅰ溶于無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，調整質量濃度為400 μg/mL。從實驗第1天開始ip人β2-糖蛋白Ⅰ與CFA體積比為1∶1的混合液50 μL；實驗第8天以IFA代替CFA加強免疫1次，劑量同第1次免疫。于實驗第18天，各組♀小鼠與♂小鼠以2∶1的比例合籠，自合籠之日起，每天早上8：00和下午14：00分別觀察1次，若觀察到角化細胞中夾有大量精子和/或見到陰栓則計為妊娠第0.5天。從妊娠第1天起各給藥組小鼠均按0.1 mL/10 g ig給藥，空白對照組和模型組小鼠ig等體積蒸餾水，每天1次，連續9 d。在妊娠第9.5天時頸椎脫臼法處死小鼠，留取胎盤組織進行相關指標測定。

2.2 RT-PCR法測定小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達水平

采用Trizol液處理剪碎的胎盤組織并提取總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA，以cDNA為模版進行擴增。反應體系：Real-time PCR Master Mix混合液10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌雙蒸水7.2 μL，體系共20 μL。在基因表達的半定量分析中，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，通過與GAPDH表達量比較實現待測基因表達量的標準化。反應條件：擴增階段為95℃、5 min；95℃、15 s，60℃、60 s，共40個循環；溶解曲線階段為95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。用RT-PCR系統自帶軟件進行溶解曲線分析，以2－ΔΔct法[9]計算目的基因mRNA的相對表達量。基因引物序列及產物長度見表1。

表1 基因引物序列及擴增長度Tab 1 Gene primers and amplification length

2.3 免疫組化法測定小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達水平

常規制備小鼠胎盤組織石蠟切片。常規脫蠟、脫水，PBS沖洗3次，每次3 min；3%雙氧水（H2O2）常溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；3%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min后加入相應一抗，濕盒4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min；加入50 μL生物素標記的二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育20 min后PBS沖洗3次，每次5 min；加入二氨基聯苯胺（DAB）顯色液，室溫下顯色2～5 min，鏡下控制；蘇木精復染，常規脫水、透明、封片。陽性產物均定位于細胞漿，以細胞漿著色呈棕褐色為陽性細胞。以計算機圖像分析軟件（Image-Pro Plus，IPP）分析TLR4、MD2、MyD88、NF-κB的積分光密度（IOD）值，以此反映陽性表達的強弱。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達水平測定結果

與空白對照組比較，模型組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林組和安子合劑低劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.01），安子合劑中劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88 mRNA表達水平降低（P＜0.05或P＜0.01），安子合劑高劑量組上述指標差異均無統計學意義（P＞0.05）；與阿司匹林組比較，安子合劑低劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κ B mRNA表達水平降低更為明顯，其中TLR4、MD2 mRNA表達水平差異有統計學意義（P＜0.01），結果詳見表2。

表2 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達水平測定結果（±s，n＝10）Tab 2 The mRNA expression levels of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表2 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達水平測定結果（±s，n＝10）Tab 2 The mRNA expression levels of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿司匹林組比較，ΔΔP＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aspirin group，ΔΔP＜0.01

組別空白對照組模型組阿司匹林組安子合劑低劑量組安子合劑中劑量組安子合劑高劑量組NF-κB 1.10±0.42 7.36±1.00＊＊5.12±2.65##3.95±1.91##5.23±3.38 5.56±4.19 TLR4 1.08±0.32 11.87±1.51＊＊6.73±2.61##3.82±0.89##ΔΔ5.99±1.64##9.51±3.86 MD2 1.10±0.33 8.37±2.73＊＊4.70±1.80##1.74±0.72##ΔΔ5.00±1.79##7.09±3.69 MyD88 1.26±0.94 3.47±1.58＊＊1.77±0.59##1.45±0.95##1.75±1.67#2.71±2.31

3.2 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達水平測定結果

與空白對照組比較，模型組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達水平不同程度地降低，除安子合劑高劑量組小鼠胎盤組織MD2、MyD88蛋白表達水平降低不顯著外其余各組差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與阿司匹林組比較，安子合劑低劑量組小鼠胎盤組織中MD2、MyD88表達水平明顯降低（P＜0.05），結果詳見表3、圖1。

表3 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達水平測定結果（±s，n＝10）Tab 3 The protein expression levels of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表3 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達水平測定結果（±s，n＝10）Tab 3 The protein expression levels of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿司匹林組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aspirin group，ΔP＜0.05

組別空白對照組模型組阿司匹林組安子合劑低劑量組安子合劑中劑量組安子合劑高劑量組NF-κB/GAPDH 2 461±868 8 823±2 262＊＊3 838±1 167##3 835±897##4 392±799##5 744±1 905#TLR4/GAPDH 2 418±917 7 935±974＊＊4 330±776##3 738±1 086##4 331±1 656##5 914±1 554#MD2/GAPDH 2 701±669 9 351±2 172＊＊6 192±1 775##4 648±1 134##Δ5 895±1 521##6 685±2 755 MyD88/GAPDH 1 951±882 8 028±2 674＊＊4 035±857##2 934±1 113##Δ5 101±1 927##5 869±2 045

4 討論

APA陽性流產是臨床難治性流產，西醫學采用抗血小板凝聚、免疫抑制等方法進行治療，但在藥物使用劑量、給藥途徑、安全性等方面需要進一步探討。南京中醫藥大學附屬醫院婦科自20世紀90年代起對APA陽性免疫性流產類疾病相繼開展了流行病學、臨床及藥理學機制等研究工作，認為脾腎兩虛、血熱夾瘀是其發病過程中的關鍵病機，并在此理論基礎上研制了具有益腎健脾、清熱和血和安胎作用的院內制劑——安子合劑。方中君藥續斷、桑寄生、菟絲子等益腎安胎以治其本，有取古方壽胎丸之意；太子參、甘草與白術相伍，健脾以補腎；苧麻根清熱涼血、止血安胎，有滋陰益腎之效；黃芩清心肝之火，配白術清熱安胎；丹參養血和血、疏通脈絡、調暢胞宮氣血，以養胎元。諸藥合用，則標本兼顧。

有研究表明，在復發性自然流產中TLR4影響了免疫耐受調節細胞CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）的表達[10-11]，TLR4信號通路下游分子NF-κB活化產生的腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎性因子能抑制CD4+CD25+Treg細胞的表達[12]。結合本課題組前期研究結果：APA陽性先兆流產患者外周血CD4+CD25+Treg細胞比例較正常孕婦減少[4]。推測APA可通過激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，介導炎癥反應，同時還可能影響CD4+CD25+Treg細胞的數量和功能，引起免疫耐受失衡，使母體對胚胎組織產生免疫排斥反應，最終導致妊娠丟失。

圖1 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達免疫組化圖（×200）Fig 1 The immunohistochemical pictures of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB protein expression in placental tissue of mice in each group（×200）

本研究結果表明，在正常妊娠小鼠母胎界面TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達水平均較低，這提示在正常妊娠狀態下TLR4/MyD88/NF-κB信號可能處于警備狀態，當母胎界面受到病原體感染時信號可迅速激活，啟動免疫保護。采用人β2-糖蛋白Ⅰ誘導造模后發現，母胎界面TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達水平均顯著升高，這證實了在APA陽性流產病理過程中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被激活，可能引起了母胎界面免疫炎癥反應、血栓形成、胎盤組織壞死等，從而導致早孕丟失和晚期妊娠并發癥發生的推斷[12-13]。阿司匹林為水楊酸類解熱鎮痛抗炎藥，是目前臨床治療抗磷脂抗體綜合征復發性流產的常用藥[14-15]，故本文以其為陽性對照。安子合劑給藥后能顯著下調母胎界面TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白的表達，這提示其能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路轉導，且低劑量安子合劑的作用較阿司匹林更為明顯；中、高劑量安子合劑下調小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達的作用不及低劑量，這表明安子合劑低劑量作為等效人臨床常用劑量具有一定的科學性，同時研究數據也提示患者應按臨床用藥指導用藥，以獲得較好臨床療效和用藥經濟性。

綜上所述，安子合劑可抑制APA陽性流產小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路轉導，這可能是其抗APA陽性流產的作用機制之一。本研究為中醫藥靶向治療免疫性、復發性流產提供了新的科學依據。

[1] Chou AK，Hsieh SC，Su YN，et al.Neonatal and pregnancy outcome in primary antiphospholipid syndrome：a 10-year experience in one medical center[J].Pediatr Neonatol，2009，50（4）：143-146.

[2] Zhou H，Sheng L，Wang H，et al.Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠstimulates activation of THP-1 cells through TLR4/MD-2/ MyD88 and NF-κB signaling pathways[J].Thromb Res，2013，132（6）：742-749.

[3] 陸啟濱，任青玲.安子合劑治療抗心磷脂抗體陽性致先兆流產191例臨床研究[J].中華臨床醫學雜志，2006，7（11）：25-27.

[4] 朱姝，陸啟濱.抗心磷脂抗體導致妊娠丟失的免疫病理機制及安子合劑的干預作用[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（11）：177-181.

[5] 丁超，陸啟濱.安子合劑對構建抗心磷脂抗體陽性流產模型小鼠mmp2、mmp9表達的影響[J].天然產物研究與開發，2014，26（6）：967-969.

[6] 許家瑩，陸啟濱，丁超.安子合劑對ACA陽性先兆流產母胎界面p-STAT3的影響[J].時珍國醫國藥，2015，26（8）：1 823-1 826.

[7] 肖世金，趙愛民，鮑世民.COX-2及其信號轉導通路的表達與自身免疫型復發性流產的關系[J].上海交通大學學報（醫學版），2011，31（7）：895-899.

[8] Tolomeo T，Rico De Souza A，Roter E，et al.T cells demonstrate a Th1-biased response to native beta2-glycoproteinⅠ in a murine model of anti-phospholipid antibody induction[J].Autoimmunity，2009，42（4）：292-295.

[9] 李莎莎，張義軍，李洪利，等.非小細胞癌中MTAP蛋白及基因表達水平的檢測[J].中國腫瘤雜志，2011，14（2）：151-155.

[10] 梅珊珊，屈艷霞，張廣蘭，等.URSA患者蛻膜調節性T細胞Toll受體表達變化的臨床意義[J].中山大學學報（醫學科學版），2014，35（4）：559-564.

[11] 杜久偉，朱瑞，王飛，等.原因不明反復自然流產患者外周血TLR2、TLR4表達及CD4+CD25+Treg細胞的變化[J].

臨床檢驗雜志，2013，31（5）：360-362.

[12] Mulla MJ，Salmon JE，Chamley LW，et al.A role for uric acid and the Nalp3 inflammasome in antiphospholipid antibody-induced IL-1β production by human first trimester trophoblast[J].PLoS One，2013，8（6）：e65237.

[13] Oku K，Amengual O，Atsumi T.Pathophysiology of thrombosis and pregnancy morbidity in the antiphospholipid syndrome[J].Eur J Clin Invest，2012，42（10）：1126-1135.

[14] 宋鈺，王海燕.復發性流產合并抗磷脂抗體綜合征診療進展[J].中國優生與遺傳雜志，2016，24（5）：9-13.

[15] 林蕓竹，申向黎，黃亮，等.妊娠早期保胎藥的新劑型研發進展[J].中國藥房，2008，19（1）：63-65.

Effects of Anzi Mixture on TLR4/MyD88/NF-κB Signaling Pathway of Antiphospholipid Antibodies Positive Abortive Mice

LIU Jing，LU Qibin（Dept.of Gynaecology，the Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM，Nanjing 210029，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Anzi mixture on Toll like receptor 4（TLR4）/myeloid differentiation factor 88（MyD88）/nuclear facter-κB（NF-κB）signaling pathway of antiphospholipid antibodies（APA）positive abortive mice，and to investigate the mechanism of anti-APA positive abortion.METHODS：BALB/c mice（female）were randomly divided into blank control group，model group，aspirin group（positive control，0.019 5 g/kg）and Anzi mixture low-dose，medium-dose and high-dose groups（37.7，75.4，150.8 g/kg，calculated by crude drug），with 10 mice in each group.Except for blank control group，other groups were given human β2-glycoproteinⅠas derivant to establish APA positive abortion model.From the first day of pregnancy，treatment groups were given relevant medicine intragastrically，and blank control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 9 d.mRNA and protein levels of TLR4，myeloid differentiation 2（MD2），MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice were determined by RT-PCR and immunohistochemical method.RESULTS：Compared with blank control group，mRNA and protein expression of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue were increased markedly in the model group（P＜0.01）.Compared with model group，mRNA and protein expression of TLR4，MD2 and MyD88 in aspirin group and Anzi mixture low-dose and medium-dose groups were decreased significantly as well as the protein expression of TLR4 in Anzi mixture high-dose group and the protein expression of NF-κB in all medicine groups（P＜0.05 or P＜0.01）.mRNA expression of TLR4 and MD2 and the protein expression of MD2 and MyD88 in Anzi mixture low-dose groups were lower than those in aspirin group（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Anzi mixture can inhibit TLR4/MyD88/ NF-κB signaling pathway of APA positive abortive mice，which may be one of anti-APA positive abortion mechanisms.

Anzi mixture；Antiphospholipid antibody；TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway；Abortive mice；Placental tissue

R285.5

A

1001-0408（2017）01-0031-05

2016-08-18

2016-10-29）

（編輯：林 靜）

江蘇省中醫藥局國家中醫臨床研究基地開放課題（No.JD201507）；江蘇省中醫藥局中醫藥領軍人才課題（No. LJ200910）；江蘇省中醫院2014年度院級課題博士項目（No.Y14019）

＊副主任中醫師，博士研究生。研究方向：流產類疾病、絕經綜合征。E-mail：13813824496@126.com

#通信作者：主任中醫師，碩士。研究方向：流產類疾病、絕經綜合征。電話：025-86617141-91403。E-mail：wenwd@nuaa.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.08