基于液滴微流控的殼寡糖植物免疫誘導(dǎo)劑熒光檢測(cè)

蒼小鑫，趙小明，鐘潤(rùn)濤，王文霞，尹 恒，朱靖博，丁 燕

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基于液滴微流控的殼寡糖植物免疫誘導(dǎo)劑熒光檢測(cè)

蒼小鑫1,2，趙小明2，鐘潤(rùn)濤3，王文霞2，尹 恒2，朱靖博1，丁 燕1※

（1. 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，大連 116034；2. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連 116023；3. 大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，大連 116026）

為了建立基于液滴微流控芯片平臺(tái)的植物免疫誘導(dǎo)劑的熒光信號(hào)檢測(cè)技術(shù)，該文設(shè)計(jì)制作了具有液滴生成結(jié)構(gòu)的芯片，制備包裹煙草（BY-2）細(xì)胞的液滴，并對(duì)包裹了細(xì)胞的液滴數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將包裹細(xì)胞的液滴孵育一氧化氮探針后使用質(zhì)量濃度為50g/mL殼寡糖處理，在熒光顯微鏡下觀測(cè)其產(chǎn)生的熒光，利用熒光酶標(biāo)儀對(duì)比采用96孔板和液滴承載的細(xì)胞的熒光變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示，水相流速為100L/h，油相流速為300L/h時(shí)，微流控芯片產(chǎn)生的液滴尺寸適合包裹細(xì)胞，其中液滴包裹單細(xì)胞的比例達(dá)22.9%。經(jīng)殼寡糖處理后的細(xì)胞在生成的液滴中產(chǎn)生了明顯的熒光，且用96孔板和液滴承載的細(xì)胞的熒光變化趨勢(shì)一致。研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)基于液滴微流控技術(shù)的植物免疫誘導(dǎo)劑的高通量篩選平臺(tái)提供參考。

微流控；包裹；熒光；植物免疫誘導(dǎo)劑；煙草細(xì)胞；殼寡糖

0 引 言

植物免疫誘導(dǎo)劑是通過(guò)激發(fā)植物自身的防衛(wèi)反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到控制植物病害效果的新型生物農(nóng)藥。國(guó)際上已經(jīng)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)商品化的植物免疫誘導(dǎo)劑有烯并異噻唑、過(guò)敏蛋白、殼寡糖等[1]。植物免疫誘導(dǎo)劑不僅能夠激發(fā)農(nóng)作物的免疫抗病性，還可以誘導(dǎo)其抗寒、抗旱，增加產(chǎn)量并改善品質(zhì)[2]。將植物免疫誘導(dǎo)劑與化學(xué)農(nóng)藥混用，可以顯著降低化學(xué)農(nóng)藥的施用量，并提高作物降解農(nóng)藥殘留的能力，對(duì)解決食品安全問(wèn)題有重要作用。盡管現(xiàn)階段已成功研發(fā)了一些植物免疫調(diào)節(jié)劑，但農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中病害種類繁多，現(xiàn)有的植物免疫誘導(dǎo)劑產(chǎn)品種類不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的復(fù)雜情況，生產(chǎn)上需要研發(fā)新的植物免疫誘導(dǎo)劑。但是，植物免疫誘導(dǎo)劑是通過(guò)激發(fā)植物自身的免疫反應(yīng)發(fā)揮功能，其本身對(duì)病原菌沒(méi)有直接的殺菌作用，傳統(tǒng)的殺菌劑篩選方法不適合植物免疫誘導(dǎo)劑產(chǎn)品，因此亟需新的技術(shù)應(yīng)用于植物免疫誘導(dǎo)劑的篩選。

對(duì)于植物免疫誘導(dǎo)劑活性篩選，國(guó)際上報(bào)道的很少，Cheong等[3]用大豆子葉法測(cè)定葡寡糖誘導(dǎo)劑的活性，該法被其他研究者應(yīng)用測(cè)定其他誘導(dǎo)劑的活性，被認(rèn)為是比較經(jīng)典的測(cè)定寡糖誘導(dǎo)劑活性的方法。但該方法比較煩瑣，費(fèi)時(shí)間，測(cè)定結(jié)果的誤差比較大。隨著植物免疫機(jī)理研究的發(fā)展，對(duì)植物免疫誘導(dǎo)劑篩選技術(shù)研究逐漸開(kāi)展。Franco等[4]以菜豆離體葉片組織胼胝質(zhì)積累為指標(biāo)，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)皿法篩選不同分子量殼聚糖誘導(dǎo)活性，該法周期長(zhǎng)，檢測(cè)繁瑣，不能高通量。Schreiber等[5]將擬南芥種在96孔板上，以植物病原丁香假單胞菌（）引起擬南芥白化癥狀為指標(biāo)，篩選了200個(gè)可以激發(fā)擬南芥植物免疫活性的化合物，篩選到三種有活性的磺胺類物質(zhì)，該法直觀、簡(jiǎn)單，但周期長(zhǎng)需要15～20 d，難于規(guī)模化。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，McCann等[6]以6種病原細(xì)菌為材料，利用生物信息學(xué)方法，分析病原菌基因組保守性特征分子，推測(cè)病原菌存在的誘導(dǎo)劑，再接種鑒定，篩選到56個(gè)肽鏈植物免疫誘抗劑。該法需要了解病原菌基因組，主要是針對(duì)蛋白類誘導(dǎo)劑，存在很大局限性，難于作為篩選平臺(tái)。Noutoshi等[7]根據(jù)病原菌誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)植物細(xì)胞程序性死亡和伊文思藍(lán)染色死細(xì)胞原理，以擬南芥懸浮細(xì)胞為材料，用96孔板法篩選具有植物免疫誘導(dǎo)劑活性化合物5個(gè)，該法接近高通量，但該法只檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)，不適合沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)劑，容易造成漏篩。能否開(kāi)發(fā)出操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本相對(duì)低廉的高通量篩選系統(tǒng)成為植物免疫篩選領(lǐng)域的重要問(wèn)題。基于微量、高通量、大規(guī)模、平行性等特點(diǎn)，近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的微流控芯片（microfluidics）被認(rèn)為是解決此問(wèn)題的有力武器。

微流控技術(shù)是一種利用微流體力學(xué)，把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、培養(yǎng)、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等操作單元高度集成[8]，用以實(shí)現(xiàn)各種生物或化學(xué)試驗(yàn)的技術(shù)，具有高通量、高靈敏度、低試劑量消耗、無(wú)交叉污染、反應(yīng)速度快的優(yōu)點(diǎn)[9]。其中的液滴微流控技術(shù)以離散的微小液滴為流動(dòng)主體，每一個(gè)形態(tài)穩(wěn)定的液滴均可視為獨(dú)立的微反應(yīng)器，減少了交叉污染，且便于操控，因此是單細(xì)胞分析[10-13]，分子生物學(xué)[14]，藥物分選[15-16]，材料合成[17-22]、化學(xué)反應(yīng)[23-26]等領(lǐng)域的理想選擇。利用液滴微流控技術(shù)的上述優(yōu)勢(shì)，將植物細(xì)胞包裹到含有熒光探針和待考察的植物激發(fā)子的液滴中，檢測(cè)并比較不同種類待考察的植物激發(fā)子誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生NO和Ca2+等植物抗性相關(guān)信號(hào)分子的能力[27-30]，是一種新的實(shí)現(xiàn)植物免疫誘導(dǎo)劑高通量篩選的技術(shù)手段。

為研究利用液滴微流控芯片進(jìn)行植物免疫誘導(dǎo)劑高通量篩選的可行性，本文考察了使用微流控芯片生成包裹煙草細(xì)胞所需要的流體力學(xué)參數(shù)，并對(duì)加載一氧化氮熒光探針和殼寡糖的煙草細(xì)胞液滴進(jìn)行熒光檢測(cè)，為進(jìn)一步研發(fā)基于液滴微流控的植物免疫誘導(dǎo)劑高通量篩選的技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

KW-4A型勻膠機(jī)：美國(guó)Chemat公司；EH20A plus熱板：美國(guó)Lab Tech公司；URE-2000/35型紫外深度光刻機(jī)：中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所；PDC-32G-2等離子體清洗器：美國(guó)Harrick公司；IX73熒光倒置顯微鏡：日本Olympus公司；Image-Pro Plus圖片處理軟件：美國(guó)Media Cybernetics公司；TJ-2A注射泵：保定蘭格恒流泵有限公司；Gemini EM熒光酶標(biāo)儀：美國(guó)分子儀器公司；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；CR21N離心機(jī)：日本日立公司。

液滴形成油：美國(guó)Biorad公司；Sylgard184聚二甲基硅氧烷（PDMS, polydimethylsiloxane）：美國(guó)Dow Corning公司；SU-8 3035光刻膠：美國(guó)Micro Chem公司；乳酸乙酯：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；異丙醇：天津博迪化工有限公司；濃H2SO4、H2O2：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；莧菜紅：上海Aladdin公司；三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷：美國(guó)sigma公司；FC-40油：美國(guó)Santa Cruz公司；KOH、KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4：均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)純；離析酶R-10、纖維素酶R-10：日本Yakult 公司； NO熒光探針（DAF-FM DA）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；殼寡糖由大連中科格萊克生物科技有限公司制備，脫乙酰度>95%，聚合度2～10；BY-2煙草細(xì)胞：中科院大連化物所天然產(chǎn)物與糖工程研究組提供。

1.2 聚二甲基硅氧烷（PDMS）液滴微流控芯片制備

芯片模板采用標(biāo)準(zhǔn)軟刻蝕工藝加工[31]。SU-8玻璃模板的制作：在H2SO4-H2O2中清洗過(guò)的70 mm×70 mm玻璃基片以第一轉(zhuǎn)速為500 r/min，10 s；第二轉(zhuǎn)速為960 r/min，30 s的速率旋涂SU-8 3035光刻膠，經(jīng)過(guò)加熱前烘后，利用曝光成像將掩膜上的圖案設(shè)計(jì)刻錄到光刻膠上，再將刻錄有圖案的光刻膠玻璃基片放在95 ℃的熱板上加熱烘烤，冷卻到25 ℃后，在乳酸乙酯中顯影，用異丙醇淋洗干凈，轉(zhuǎn)移至熱板180 ℃堅(jiān)膜，冷卻至25 ℃；PDMS芯片澆注成型：將PDMS預(yù)聚液與固化劑按體積比10:1混合均勻，倒入SU-8模板，利用真空泵抽走小氣泡，80 ℃固化成型后揭下，切割、打孔，與涂有PDMS的載玻片在等離子腔內(nèi)照射，取出，迅速封接，隨后在80 ℃烘箱加固封接。

1.3 莧菜紅液滴的制備及液滴大小的測(cè)量

試驗(yàn)采用流動(dòng)共聚焦[32]的PDMS芯片形成油包水的液滴（芯片結(jié)構(gòu)如圖1所示），油相為液滴形成油，水相為飽和的莧菜紅水溶液。使用注射泵調(diào)節(jié)流體的速率（油相流速分別為200、300、400L/h；水相流速為100L/h）。將水相流速固定為100L/h，油相流速為200L/h時(shí)，將生成的液滴收集并在顯微鏡下觀察，利用圖像處理軟件隨機(jī)拍攝10個(gè)視野，每個(gè)視野10個(gè)液滴，并測(cè)量這100個(gè)液滴的直徑，取平均值，得到該流速下液滴的大小，并計(jì)算誤差范圍。按照同樣的方法，獲得油相為300、400L/h時(shí)液滴的尺寸。

1.4 制備BY-2煙草細(xì)胞懸液

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮培養(yǎng)的BY-2細(xì)胞100mL，用封口膜封住瓶口，置于25 ℃左右的黑暗條件下酶解去除細(xì)胞壁，酶為纖維素酶（10 000 u/g）和離析酶（3 000 u/g），酶解時(shí)間約3～5 h。一般在3～4 h后，用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，待足量的原生質(zhì)體游離下來(lái)以后即可繼續(xù)進(jìn)行下面的操作。用槍將含有原生質(zhì)體的酶液通過(guò)300目的鎳絲網(wǎng)，過(guò)濾到15 mL的離心管中，除去未被酶液消化的細(xì)胞。濾液用離心機(jī)離心，500 r/min，約3 min，使完整的原生質(zhì)體沉淀用吸管除去酶液，添加洗滌液（0.6 mol/L甘露醇，3.5 mmol/L CaCl2，0.7 mmol/L KH2PO4，pH值為5.6），小心將原生質(zhì)體懸浮，待懸浮液充分混勻后，再一次進(jìn)行離心。使用0.33 mol/L蔗糖溶液（煙草細(xì)胞的等滲濃度）懸浮細(xì)胞。

1.5 制備包裹BY-2細(xì)胞的液滴

利用與BY-2煙草細(xì)胞等滲濃度的蔗糖溶液配置成不同光密度（OD, optical density）值的細(xì)胞懸浮液。油相為伯樂(lè)油，流速為300L/h；水相為細(xì)胞懸浮溶液，流速為100L/h。利用液滴生成芯片生成液滴。

1.6 單細(xì)胞包裹率的統(tǒng)計(jì)及分析

單細(xì)胞包裹率是指包裹單個(gè)細(xì)胞的液滴數(shù)目占液滴總數(shù)目的比例。在顯微鏡下觀察微液滴包裹細(xì)胞的情況。隨機(jī)選取視野，使每個(gè)視野中包含至少10個(gè)液滴，對(duì)這10個(gè)液滴的包裹情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 一氧化氮熒光探針（DAF-FM DA）的孵育及殼寡糖的誘導(dǎo)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BY-2懸浮細(xì)胞2 mL加入10 mL離心管中，然后加入1L 5mmol/L DAF-FM DA，25 ℃，120 r/min黑暗孵育1 h，將細(xì)胞沉淀，用200L移液槍吸除上清液，用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液清洗去除多余的探針三次，再加入8 mL新鮮的培養(yǎng)基，黑暗室溫120 r/min孵育30 min，然后將細(xì)胞混勻，加入6孔板中，每孔2 mL細(xì)胞懸液，用熒光顯微鏡觀測(cè)NO的產(chǎn)生情況（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm；發(fā)射波長(zhǎng)510 nm），以50g/mL質(zhì)量濃度殼寡糖處理孵育探針的細(xì)胞30 min后，用熒光顯微鏡觀察NO熒光產(chǎn)生情況。

1.8 制備包裹殼寡糖刺激后的細(xì)胞液滴

結(jié)合操作1.5和1.7，將一氧化氮探針?lè)跤⑹艿綒す烟穷A(yù)處理后的細(xì)胞微液滴在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)觀察到的熒光強(qiáng)弱的差別給予評(píng)價(jià)。

1.9 液滴中與96孔板中細(xì)胞的熒光強(qiáng)度對(duì)比

結(jié)合1.7中所述的方法，孵育一氧化氮熒光探針（DAF-FM DA）的煙草細(xì)胞和液滴中的細(xì)胞置于黑色96孔板中，利用熒光酶標(biāo)儀對(duì)其1 h內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行測(cè)定并對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 液滴生成芯片設(shè)計(jì)

本研究應(yīng)用帶有通道匯流結(jié)構(gòu)區(qū)域的微流控芯片以制備微液滴。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)的煙草細(xì)胞其直徑為60～240m，考慮到懸浮培養(yǎng)的煙草細(xì)胞易于成團(tuán)生長(zhǎng)，較大的微流控通道寬度不易造成通道阻塞，因此將芯片的通道寬度設(shè)定為350m；液滴生成區(qū)域的通道寬度設(shè)定為250m；通道加工深度為120m（如圖1所示）。油相注入到芯片后，細(xì)胞懸液被油相在十字型匯流縮口處被油相的剪切力夾斷，形成連續(xù)的液滴。

2.2 液滴生成芯片中油相流速的調(diào)節(jié)

對(duì)于通道寬度和高度已確定的芯片，可以通過(guò)調(diào)節(jié)油相和水相的流速來(lái)控制液滴的大小。以溶有莧菜紅染料的水相進(jìn)行液滴生成模擬試驗(yàn)，將莧菜紅水溶液流量固定為100L/h，調(diào)節(jié)油相流速，如表1所示，分別為400、300、200L/h，以考察不同流動(dòng)相比例對(duì)生成液滴直徑尺寸的影響。液滴生成效果如圖2所示。通過(guò)圖2b和表1中的數(shù)據(jù)結(jié)合分析可以得出，當(dāng)水相為100L/h，油相為300L/h時(shí)，生成的液滴大小及頻率最為穩(wěn)定，最適合BY-2煙草細(xì)胞的包裹。

表1 液滴大小與油相流量的關(guān)系

a. 莧菜紅液滴的生成過(guò)程

a. Formation of amaranth droplets

2.3 液滴中單細(xì)胞包裹率的統(tǒng)計(jì)及分析

利用酶解法去除懸浮培養(yǎng)的煙草細(xì)胞（100 mL）的細(xì)胞壁，然后用300目鎳絲網(wǎng)過(guò)濾，將得到的濾液在25 ℃，1 000r/min，5min條件下離心，細(xì)胞沉淀后用200L移液槍去除上清液，得到一定量沉淀的細(xì)胞后，用等滲濃度的蔗糖溶液進(jìn)行稀釋，通過(guò)調(diào)控加入蔗糖溶液體積的方法將細(xì)胞配置成不同濃度的細(xì)胞懸液，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD值。參考莧菜紅溶液試驗(yàn)結(jié)果，將一定OD值的細(xì)胞懸液以100L/h，油相為300L/h的流速在微流控芯片中進(jìn)行包裹。將生成的液滴在顯微鏡下觀測(cè)拍照，如圖3a、3b所示。并對(duì)每個(gè)視野內(nèi)的10個(gè)液滴的包裹進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，包裹了單細(xì)胞的液滴符合泊松分布，當(dāng)細(xì)胞的OD值為1.375時(shí)，單細(xì)胞的包裹率為5.7%，空細(xì)胞為90.0%，兩個(gè)或兩個(gè)以上的包裹率為4.3%。當(dāng)OD值為1.478時(shí)，將單個(gè)細(xì)胞包裹在直徑為300m，體積為84.78 nL的微液滴中（液滴可視為球體），單細(xì)胞的包裹率可達(dá)22.9%，空細(xì)胞的包裹率為70.0%，兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞的包裹率為7.1%，結(jié)果如圖3c所示。

2.4 殼寡糖誘導(dǎo)煙草細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生及熒光檢測(cè)

將一氧化氮熒光探針（DAF-FM DA）孵育到BY-2煙草細(xì)胞中，并用50g/mL的殼寡糖水溶液進(jìn)行誘導(dǎo)。前期的試驗(yàn)已證明50g/mL的殼寡糖誘導(dǎo)煙草植株抗病效果較好[29]，可以顯著激發(fā)植物細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮等信號(hào)分子。因此，本研究對(duì)50g/mL的殼寡糖處理煙草細(xì)胞時(shí)一氧化氮的產(chǎn)生情況進(jìn)行研究，考察細(xì)胞經(jīng)殼寡糖處理后產(chǎn)生熒光的情況。結(jié)果如圖4所示，殼寡糖預(yù)處理后的煙草細(xì)胞經(jīng)過(guò)一氧化氮探針的檢測(cè)，在顯微鏡下可以觀察到顯著的熒光。

c. 液滴中BY-2細(xì)胞的泊松分布圖

c. Poisson distribution of BY-2 cells in droplets

注：圖b紅色箭頭指向的是液滴中包裹到的煙草細(xì)胞

Note: Fig. b Red arrow point to BY-2 cell encapsulated in a droplet

圖3 空液滴和包裹細(xì)胞液滴的對(duì)比圖

Fig.3 Contrast figure of empty droplets and encapsulated cells in droplets

2.5 液滴中細(xì)胞熒光的檢測(cè)

將BY-2細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)一氧化氮探針?lè)跤⑹褂?0g/mL殼寡糖誘導(dǎo)后，包裹于微液滴中，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)，如圖5所示。未經(jīng)一氧化氮探針?lè)跤蜌す烟穷A(yù)處理的細(xì)胞沒(méi)有發(fā)射出熒光；經(jīng)過(guò)一氧化氮探針?lè)跤唇?jīng)殼寡糖預(yù)處理的細(xì)胞在激發(fā)光源的激發(fā)下，也沒(méi)有顯示出顯著的熒光；在經(jīng)一氧化氮探針?lè)跤⒔邮軞す烟穷A(yù)處理后的細(xì)胞，在激發(fā)光源的作用下，發(fā)射出明顯的熒光。結(jié)果顯示，微液滴包裹的細(xì)胞經(jīng)探針?lè)跤⑹艿郊ぐl(fā)子的誘導(dǎo)作用后，其產(chǎn)生的一氧化氮與探針結(jié)合，在激發(fā)光源的作用下可以發(fā)射出明顯的熒光。

2.6 微液滴與96孔板中BY-2細(xì)胞受殼寡糖誘導(dǎo)后的熒光對(duì)比

將經(jīng)過(guò)50g/mL殼寡糖刺激后的BY-2細(xì)胞分別包裹在液滴中和置于黑色96孔板中，利用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)各自熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)。由圖6中可見(jiàn)，1 h內(nèi)兩者的熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)基本相符，由此可見(jiàn)在96孔板及液滴中BY-2細(xì)胞被殼寡糖誘導(dǎo)后產(chǎn)生的反應(yīng)趨勢(shì)基本一致。此結(jié)果說(shuō)明利用微液滴包裹細(xì)胞進(jìn)行植物免疫誘導(dǎo)劑熒光篩選，與傳統(tǒng)的篩選方法相比具有相似表現(xiàn)效果。

3 討 論

Wang等[33]報(bào)道酵母細(xì)胞在液滴中包裹情況遵循泊松分布，即，其中代表的是每個(gè)液滴中細(xì)胞的平均個(gè)數(shù)，代表的是理想狀況下每個(gè)液滴中的細(xì)胞個(gè)數(shù)，因此當(dāng)=1，=1時(shí)，即理想狀況下每個(gè)液滴中只包裹一個(gè)細(xì)胞的概率可以達(dá)到36.7%。而試驗(yàn)中會(huì)因?yàn)閷?shí)際包裹的物質(zhì)不同而有所差別。植物細(xì)胞不同于微生物、微藻和動(dòng)物細(xì)胞，它在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下，細(xì)胞是成團(tuán)粘結(jié)在一起生長(zhǎng)的，因此需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一系列的處理使其較為分散，得到一定濃度的懸浮液，才能利用通道芯片進(jìn)行包裹。利用液滴微流控芯片對(duì)植物細(xì)胞的包裹以前并未見(jiàn)過(guò)報(bào)道，因此本文是第一次嘗試植物細(xì)胞的包裹并對(duì)其包裹概率進(jìn)行探究，得到22.9%的植物細(xì)胞包裹率，此包裹率能夠滿足本試驗(yàn)的需求，但同時(shí)也表明提高煙草細(xì)胞包裹率的方法是后續(xù)研究的重要內(nèi)容。

Zhao等[29]利用常規(guī)方法驗(yàn)證了50g/mL的殼寡糖可以刺激煙草細(xì)胞產(chǎn)生免疫防御反應(yīng)，從而證明了殼寡糖是一種有效的植物免疫誘導(dǎo)劑，可以預(yù)防煙草花葉病。本文利用液滴作為載體，利用液滴微流控芯片平臺(tái)驗(yàn)證殼寡糖刺激煙草細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，能夠使裝載一氧化氮熒光探針（DAF-FM DA）的BY-2細(xì)胞產(chǎn)生熒光。試驗(yàn)中將液滴包裹的細(xì)胞和96孔板中細(xì)胞經(jīng)殼寡糖刺激后的熒光變化趨勢(shì)進(jìn)行對(duì)比，證明96孔板和液滴微流控芯片在檢測(cè)具有一定的一致性。該試驗(yàn)的側(cè)重點(diǎn)在于證明液滴微流控芯片平臺(tái)的可行性。對(duì)包裹不同細(xì)胞個(gè)數(shù)的液滴實(shí)現(xiàn)分離篩選以及對(duì)單細(xì)胞液滴熒光信號(hào)異質(zhì)性分布還需進(jìn)一步研究。

每一個(gè)液滴都是一個(gè)微小的環(huán)境，液滴內(nèi)的細(xì)胞可以和激發(fā)子快速均勻的混合，且能夠依次均勻的分布在孔板內(nèi)，而在96孔板的一個(gè)孔內(nèi)，以懸浮液存在的細(xì)胞會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生聚集的現(xiàn)象，使其在孔板內(nèi)分布不均勻，因此當(dāng)熒光酶標(biāo)儀的光束均勻透過(guò)孔板時(shí)，由于液滴分布均勻，檢測(cè)光束均勻照射孔中的細(xì)胞，而以細(xì)胞懸液形式存在的孔，因?yàn)榧?xì)胞聚集成團(tuán)，使檢測(cè)光束不能均勻完整的照射到所有細(xì)胞，因此液滴包裹的細(xì)胞的熒光會(huì)強(qiáng)于孔板內(nèi)只含有細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，靈敏度更高。雖然存在檢測(cè)靈敏度的不同，但兩者的效應(yīng)機(jī)制相同，所以熒光變化的趨勢(shì)一致。由此可見(jiàn)，液滴微流控芯片可以用來(lái)做殼寡糖植物免疫誘導(dǎo)劑熒光檢測(cè)試驗(yàn)，且相比96孔板具有更高的靈敏度，是一個(gè)更有優(yōu)勢(shì)的實(shí)驗(yàn)分析載體。

本試驗(yàn)的目的是為了證明基于液滴微流控技術(shù)對(duì)植物免疫誘導(dǎo)劑高通量篩選具有可行性，在后續(xù)試驗(yàn)中將制備集成液滴生成、孵育、篩選等多種功能模塊一體的芯片，同時(shí)結(jié)合NO、Ca2+等熒光探針，依靠熒光信號(hào)的反饋，最終實(shí)現(xiàn)高通量的液滴分選，為基于液滴微流控芯片技術(shù)的糖鏈植物免疫誘導(dǎo)劑高通量篩選平臺(tái)的研制提供參考。

4 結(jié) 論

1）基于液滴微流控技術(shù)，將單個(gè)細(xì)胞包裹在直徑為300m，體積為84.78 nL的微液滴中（液滴可視為球體），包裹率可達(dá)22.9%，并符合泊松分布。

2）將一氧化氮熒光探針?lè)跤紹Y-2煙草細(xì)胞中，并用50g/mL質(zhì)量濃度的殼寡糖水溶液進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果顯示在激發(fā)光源的作用下，液滴中的細(xì)胞發(fā)射出明顯的熒光。將液滴受殼寡糖誘導(dǎo)的細(xì)胞和96孔板中受相同處理的細(xì)胞熒光對(duì)比，發(fā)現(xiàn)微液滴中的BY-2細(xì)胞其熒光變化趨勢(shì)與96孔板中的細(xì)胞熒光變化趨勢(shì)相同，說(shuō)明微液滴包裹植物細(xì)胞在熒光檢測(cè)的角度與傳統(tǒng)的孔板檢測(cè)結(jié)果具有一致性，且具有較高靈敏度。

本研究將植物細(xì)胞與液滴微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，為單個(gè)植物細(xì)胞的分析研究提供了新的平臺(tái)，為基于液滴微流控芯片技術(shù)的糖鏈植物免疫誘導(dǎo)劑高通量篩選平臺(tái)的研制提供了參考。

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Fluorescence detection of chitosan oligosaccharides plant immune elicitors based on droplets-microfluidics

Cang Xiaoxin1,2, Zhao Xiaoming2, Zhong Runtao3, Wang Wenxia2, Yin Heng2, Zhu Jingbo1, Ding Yan1※

(1.,,116034,;2.,,116023,;3.,,116026,)

The plant immune elicitors can induce a line of defense responses in plants and are identifed as new type of biological pesticides. At present stage, new plant immune elicitor is screening with potted plants or field experiments, which is time-consuming and high-cost. The droplet microfluidic technology, which is originated from analytical chemistry and owns micro-channel network structure, has properties of high throughput, high sensitivity, low consumption of reagent, no cross contamination and rapid reaction. These advantages provide a novel platform for screening plant immune elicitors. Chitosan oligosaccharides (COS) are obtained by degradation of chitosan. It was reported that COS could activate plant innate immunity, such as: stimulate H2O2(hydrogen peroxide)production, induce defense response by NO (nitric oxide) pathway, make a synthesis of phytoalexin, impact the jasmonic acid / ethylene (JA/ET) signaling marker, trigger defense-related gene expression, cause changes in protein phosphorylation, activate mitogen-activated protein kinases (MAPKs), and possess antimicrobial activity against bacteria and fungi in plant. Because of the advantages and the high solubility, nontoxicity, and biocompatibility, COS are considered as an effective plant immune elicitor by researchers. To preliminarily applying droplet microfluidic technology in plant immune elicitor screening, integrated microfluidic chip with droplets formation structure was designed and fabricated. COS were chosen as positive reagent, and BY-2 tobacco cells played as model plant cell. The flow rate of mobile phase was measured and established for BY-2 tobacco cells droplets formation, and the single cell encapsulating efficiency was calculated. Then COS and NO probe were dumped into the droplets with BY-2 tobacco cells, and the fluorescence intensity of NO probe from droplets was detected to evaluate the feasibility of screening the plant immune elicitor COS. To make the comparative analysis, the fluorescence intensity was compared with the same reaction system in 96-well plate. The results showed that at the flow rates of 100L/h in cell suspension and 300L/h in oil, the sizes of generated droplets were suitable to encapsulate the cells. The BY-2 cell clusters could be dispersed in isotonic solution, and every droplet encapsulated single cell. The ratio of droplets encapsulating single cell was about 22.9%. The ratio conformed to Poisson distribution. The fluorescence intensity of droplets incubated with COS was detected by fluorescence microscope. The fluorescence intensity from the COS/NO probe/BY-2 cell group was significantly higher than the control groups. In the comparative analysis experiments, the fluorescence intensity of droplets showed similar trend compared with the same reaction system in 96-well plate. This result implied that the cell treated with COS in droplets showed similar trend in defense responses compared to traditional screening method with 96-well plate. Thus, the droplets with COS / NO probe / BY-2 cell show high fluorescence intensity that can be detected by fluorescence microscope, which implies that integrated with fluorescence detecting technique, droplets microfluidics and fluorescence probe can be a novel platform for screening plant immune elicitors.

microfluidic; encapsulation; fluorescence; plant immune elicitors; BY-2 tobacco cell; chitosan oligosaccharide

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.02.042

S4

A

1002-6819(2017)-02-0302-06

2016-07-21

2016-11-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（31370391）；中科院STS計(jì)劃（KFJ-SW-STS-143）；大連市人才項(xiàng)目（2016RQ064）；遼寧省教育廳項(xiàng)目（2016J008）

蒼小鑫，女（滿族），黑龍江雙城人，主要從事植物免疫誘導(dǎo)劑方向的研究。大連 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，116034。Email：iceycang@foxmail.com

丁 燕，女，吉林白山人，博士，主要從事天然產(chǎn)物方向的研究。大連 大連工業(yè)大學(xué)，116034。Email：dingyan_515@hotmail.com

蒼小鑫，趙小明，鐘潤(rùn)濤，王文霞，尹 恒，朱靖博，丁 燕. 基于液滴微流控的殼寡糖植物免疫誘導(dǎo)劑熒光檢測(cè)[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2017，33(2)：302－307. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.02.042 http://www.tcsae.org

Cang Xiaoxin, Zhao Xiaoming, Zhong Runtao, Wang Wenxia, Yin Heng, Zhu Jingbo, Ding Yan. Fluorescence detection of chitosan oligosaccharides plant immune elicitors based on droplets-microfluidics[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(2): 302－307. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.02.042 http://www.tcsae.org