葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)的快速分子檢測(cè)

馬仲文

(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，福建 福州 350303)

葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)的快速分子檢測(cè)

馬仲文

(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，福建 福州 350303)

為建立快速檢測(cè)葡萄灰霉病菌的方法，根據(jù)ITS序列的差異，設(shè)計(jì)了1對(duì)葡萄灰霉病菌PCR檢測(cè)的特異性引物TBCF/TBCR，并利用該引物通過常規(guī)和巢式PCR對(duì)葡萄灰霉病菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在優(yōu)化的反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件下，只有以葡萄灰霉病菌基因組DNA為模板的擴(kuò)增體系中具有1條386 bp的條帶，而其它病菌不產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)；其常規(guī)PCR對(duì)葡萄灰霉病菌基因組DNA的檢測(cè)靈敏度為100 pg/25 μL，而利用引物ITS1/ITS4和TBCF/TBCR通過巢式PCR擴(kuò)增，其靈敏度可達(dá)10 fg/25 μL。研究表明建立的PCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)準(zhǔn)確而操作簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，可用于帶菌土壤及發(fā)病組織中葡萄灰霉病菌的檢測(cè)。

葡萄灰霉病菌；ITS分析；特異引物；分子檢測(cè)

由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)侵染引起的葡萄灰霉病是葡萄栽培中高危害、高損失且影響果實(shí)產(chǎn)量、品質(zhì)和安全的最主要病害之一[1]。該菌可通過侵染葡萄植株的葉片、莖桿、花和果實(shí)導(dǎo)致葡萄灰霉病的發(fā)生，病原菌在土壤或病殘?bào)w上能以菌絲或菌核形式休眠越過冬天或夏天，溫濕度適宜時(shí)萌發(fā)形成大量的分生孢子后憑風(fēng)雨飛散或借農(nóng)事操作傳播引起葡萄植株感病，發(fā)病處新生的分生孢子能夠進(jìn)行重復(fù)再侵染，從而導(dǎo)致病情極易擴(kuò)展和加重[2]。在中國，葡萄灰霉病一般年份造成20%左右的減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)超過50%；該病在全國各地普通發(fā)生，且呈上升趨勢(shì)，成為當(dāng)前葡萄生產(chǎn)上的重要病害[3-4]。葡萄灰霉病常與葡萄其它病害混合發(fā)生，給病害正確診斷造成困難，而生產(chǎn)上則常因不明發(fā)病原因，難以采取有針對(duì)性的防治措施[5]。

傳統(tǒng)病原菌的分類與鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特性及致病性測(cè)定等，該方法存在著耗時(shí)長(zhǎng)、程序繁瑣、經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)等缺點(diǎn)，難以對(duì)病害做到及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用PCR擴(kuò)增病原菌核糖體ITS(internal transcribed spacer)序列進(jìn)行病原菌鑒定、檢測(cè)及病害診斷得到了迅速發(fā)展[6-7]。PCR擴(kuò)增檢測(cè)病原菌具有快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，因而受到研究人員的重視[8]。本研究通過對(duì)葡萄灰霉病菌及其親緣關(guān)系較近的相關(guān)病原菌的ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)出1對(duì)可用于特異性檢測(cè)葡萄灰霉病菌的PCR引物，以期為葡萄灰霉病菌的準(zhǔn)確鑒定和快速檢測(cè)提供技術(shù)和方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株及其來源如表1所示。

表1 供試菌株的編號(hào)、寄主及來源

1.2 葡萄灰霉病離體葉片的人工接種

采取葡萄品種(巨峰)頂葉往下第5片葉，采用菌絲塊粘貼離體葉片的方法人工接種葡萄灰霉病菌。接種7 d后，從離體接種葉片上取發(fā)病組織備用。

1.3 供試材料基因組DNA提取

所有供試菌株、健康組織、田間自然發(fā)病組織和人工接種發(fā)病組織的基因組DNA均采用CTAB法[9]提取，土壤微生物基因組總DNA提取參照文獻(xiàn)[10]的方法。

1.4 ITS序列分析及葡萄灰霉病菌特異引物的設(shè)計(jì)與合成

利用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和TIS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增葡萄灰霉病菌的ITS。PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化生物科技有限公司)12.5 μL、10 μmol/L ITS1/ITS4引物各1.0 μL、DNA 模板1.0 μL(2.0×10-5～200 ng)，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物于含0.5 μg/mL溴化乙錠(ethidium bromide, EB)的1.0%瓊脂糖膠上電泳分離，電泳分離后，將目的條帶切膠并利用膠回收試劑盒(北京天根生化生物科技有限公司)回收，與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，挑取陽性克隆送上海生工生物工程股份公司進(jìn)行測(cè)序。

利用DNAman軟件將測(cè)定的ITS序列和葡萄灰霉病菌同屬的其它種及親緣相近的相關(guān)病原菌ITS序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，選取序列間有差異位點(diǎn)的區(qū)域設(shè)計(jì)葡萄灰霉病菌特異性引物(TBCF/TBCR)，引物委托上海生工生物工程股份公司合成。

1.5 PCR引物特異性驗(yàn)證

為確保具有強(qiáng)特異性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和產(chǎn)物的高得率，對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件進(jìn)行了充分的優(yōu)化，建立了PCR最佳擴(kuò)增條件。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化生物科技有限公司) 12.5 μL、10 μmol/L引物TBCF/TBCR各1.0 μL、DNA模板1.0 μL(2.0×10-5～200 ng)，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。利用建立好的PCR擴(kuò)增條件，對(duì)所有供試菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后取5.0 μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并檢測(cè)條帶的有無。

1.6 PCR引物靈敏度檢測(cè)

用紫外分光光度計(jì)對(duì)所提取的葡萄灰霉病菌基因組DNA濃度進(jìn)行測(cè)定，并將基因組DNA濃度調(diào)整為10 μg /μL，并按10倍梯度進(jìn)行稀釋。利用常規(guī)PCR和巢式PCR對(duì)不同濃度的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，常規(guī)PCR的反應(yīng)體系及擴(kuò)增參數(shù)，以及引物同1.5。巢式PCR反應(yīng)的具體步驟如下：第一輪采用ITS1/ITS4引物進(jìn)行擴(kuò)增，其反應(yīng)體系及擴(kuò)增參數(shù)同1.4；第一輪反應(yīng)結(jié)束后，取1.0 μL第一輪反應(yīng)產(chǎn)物為模板，與TBCF/TBCR引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系和擴(kuò)增參數(shù)同1.5。常規(guī)PCR和巢式PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5.0 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，并在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察。

1.7 發(fā)病葉片組織中葡萄灰霉病菌的檢測(cè)

取自然發(fā)病和人工接種發(fā)病的葡萄灰霉病葉片，采用CTAB提取其基因組DNA，以葡萄灰霉病菌菌株純培養(yǎng)物的基因組DNA為陽性對(duì)照，通過常規(guī)PCR和巢式PCR檢測(cè)發(fā)病葉片中的病原菌，其反應(yīng)體系和擴(kuò)增參數(shù)參照1.6。

1.8 發(fā)病田塊土壤中葡萄灰霉病菌的檢測(cè)

采用常規(guī)PCR和巢式PCR對(duì)1.3中所提取的葡萄灰霉病發(fā)病田塊土壤微生物基因組總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)發(fā)病田塊土壤中是否存在灰霉病菌，以高壓滅菌的土壤和無菌超純水為陰性對(duì)照，以葡萄病菌菌株純培養(yǎng)物的基因組DNA為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS擴(kuò)增及特異引物設(shè)計(jì)

利用ITS通用引物ITS1/ITS4對(duì)供試葡萄灰霉病菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子量約為551 bp的條帶。將測(cè)序得到的葡萄灰霉病菌的ITS序列與GeneBank中近緣種的ITS序列進(jìn)行多重比較分析，先取上游片段大小為127～146 bp、下游片段512～531 bp位置的差異位點(diǎn)，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，根據(jù)序列差異，設(shè)計(jì)葡萄灰霉病菌特異引物TBCF(5′-GCTCGCCAGAGAATACCAAA-3′)和TBCR(5′-CCTACCTGATCCGAGGTCAA-3′)，委托上海生工生物工程股份公司合成。

2.2 引物特異性驗(yàn)證

用所設(shè)計(jì)的特異性引物TBCF/TBCR對(duì)所有供試菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅B.cinerea基因組DNA能擴(kuò)增出1條約386 bp的特異性條帶，與預(yù)計(jì)結(jié)果一致(圖1)。結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的該對(duì)引物具有特異性，能夠區(qū)別B.cinerea與其它病原菌。

泳道M為2000 bp DNA Marker，泳道1～3為葡萄灰霉病菌，泳道4～7分別為葡萄炭疽病菌、葡萄黑痘病菌、辣椒青枯病菌和大豆炭疽菌，泳道8為陰性對(duì)照。

圖1 TBCF/TBCR引物PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3 引物靈敏度檢測(cè)

引物TBCF/TBCR通過常規(guī)PCR可從高于100 pg(含100 pg)的菌株基因組DNA中擴(kuò)增到目的條帶(圖2-a)，其靈敏度為100 pg/25 μL；而ITS通用引物ITS1/ITS4和葡萄灰霉病菌特異引物TBCF/TBCR結(jié)合起來進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，可從高于10 fg(包括10 fg)的菌株基因組DNA中擴(kuò)增到目的條帶(圖2-b)，其靈敏度為10 fg/25 μL。巢式PCR的靈敏度是常規(guī)PCR的10000倍。

a為常規(guī)PCR對(duì)葡萄灰霉病菌的靈敏性檢測(cè)結(jié)果，b為巢式PCR對(duì)葡萄灰霉病菌的靈敏性檢測(cè)結(jié)果。泳道M為2000 bp DNA Marker，泳道1～10分別為：100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、陰性對(duì)照。

圖2 葡萄灰霉病菌常規(guī)PCR和巢式PCR的檢測(cè)靈敏度

2.4 發(fā)病組織、土壤中病原菌的檢測(cè)

采用巢式PCR對(duì)葉片組織和土壤中葡萄灰霉病菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，用巢式PCR可從自然發(fā)病、人工接種的葡萄葉片和發(fā)病田的土壤中檢測(cè)到葡萄灰霉病菌，而健康葉片組織、高壓滅菌土壤和陰性對(duì)照均未擴(kuò)增到目的條帶(圖3)，說明引物TBCF/TBCR能特異性檢測(cè)到發(fā)病組織和土壤中葡萄灰霉病菌。

泳道M為2000 bp DNA Marker，泳道1～8分別為：陽性對(duì)照、自然發(fā)病的葡萄葉片、人工接種的葡萄葉片、發(fā)病田塊的土壤、健康葡萄葉片、健康葡萄葉片、高壓滅菌的土樣、陰性對(duì)照。

圖3 引物TBCF/TBCR對(duì)發(fā)病組織和土壤中葡萄灰霉病菌的PCR擴(kuò)增檢測(cè)

3 討論

隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展和在不同學(xué)科之間的滲透，PCR在植物病害快速診斷方面得到了廣泛的應(yīng)用[11-13]。與植物病害傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、致病性等診斷方法相比，PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，尤其在那些用常規(guī)方法研究較困難的植物病害，如類病毒、植原體等，以及專性寄生病原菌的檢測(cè)，PCR 技術(shù)的應(yīng)用更顯示出其優(yōu)越性[12]。建立植物病害PCR快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于防止病害從發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，以及對(duì)病害的及時(shí)控制具有重要意義。

利用真菌ITS序列在種內(nèi)不同菌株間高度保守，又在屬間及屬內(nèi)不同種間存在著豐富的多態(tài)性，對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析，再設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)病害的診斷和植物病原真菌的分子檢測(cè)，目前已得到廣泛的應(yīng)用[11-13]。本研究對(duì)葡萄灰霉病菌與近緣種ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)出了1對(duì)葡萄灰霉病菌PCR引物TBCF/TBCR，利用TBCF/TBCR對(duì)供試的病原菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只在葡萄灰霉病菌中能擴(kuò)增出1條約386 bp的條帶，而其它病原菌和陰性對(duì)照均無擴(kuò)增條帶，說明本研究所設(shè)計(jì)的引物對(duì)葡萄灰霉病菌具有很強(qiáng)的特異性。與常規(guī)PCR相比，巢式PCR可大大提高檢測(cè)靈敏度[12-13]，利用引物TBCF/TBCR進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，其靈敏度為100 pg/25 μL，而將ITS通用引物ITS1/ITS4與引物TBCF/TBCR結(jié)合起來進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，其靈敏度可達(dá)10 fg/25 μL，大大提高了PCR檢測(cè)水平。利用巢式PCR對(duì)葡萄葉片和土壤中的葡萄灰霉病菌進(jìn)行檢測(cè)，可從發(fā)病組織和發(fā)病田塊土壤中檢測(cè)到葡萄灰霉病菌，表明利用所設(shè)計(jì)的引物建立起的葡萄灰霉病菌的PCR檢測(cè)體系可用于葡萄組織和土壤中葡萄灰霉病菌的分子檢測(cè)與病害的早期診斷。

本研究建立的葡萄灰霉病菌PCR檢測(cè)技術(shù)只能對(duì)葡萄組織和土壤中是否存在該病菌進(jìn)行定性檢測(cè)，尚不能進(jìn)行定量測(cè)定。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展和提高，目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR已被廣泛成功地應(yīng)用于植物組織和土壤中病原菌的定量檢測(cè)中[14-15]，此項(xiàng)技術(shù)有望在葡萄灰霉病菌的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中得到利用。

[1] Mlikota G F, Smilanick J L. Postharvest control of table grape gray mold on detached berries with carbonate and bicarbonate salts and disinfectants[J]. American Journal of Enology Viticulture, 2001, 52(1): 12-20.

[2] 伏波,姚娟妮,高小寧,等.植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌Em7菌株對(duì)葡萄灰霉病菌的抑菌活性[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2016,18(4):465-471.

[3] 張瑋,喬廣行,黃金寶,等.中國葡萄灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性檢測(cè)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(6):1208-1212.

[4] 陳宇飛,文景芝,李立軍.葡萄灰霉病研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37(5):693-699.

[5] 錢恒偉,趙宇,黃金光.青島地區(qū)葡萄灰霉病病原鑒定及病害分析[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,47(7):87-90.

[6] 李依韋,銀玲.rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,27(1):66-67.

[7] 趙杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子檢測(cè)中的應(yīng)用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(4):35-37.

[8] 王曉杰,康振生,黃麗麗.PCR技術(shù)在植物病害檢測(cè)中的應(yīng)用[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,20(2):179-182.

[9] 薩姆布魯克J,拉塞爾DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培唐,王嘉璽,朱厚礎(chǔ),等譯.第一版.北京:科學(xué)出版社,2002:461-512.

[10] Volossiouk T, Robb E J, Nazar R N. Direct DNA extraction for PCR-mediated assays of soil organisms[J]. Applied and Enviromental Microbiology, 1995, 61(11): 3972-3976.

[11] Zhang Z G, Zhang J Y, Zheng X B, et al. Molecular distinctions betweenPhytophthoracapsiciandP.tropicalisbased on ITS sequences of ribosomal DNA[J]. Journal of Phyopathology, 2004, 152: 358-364.

[12] Zhang Z G, Li Y Q, Fan H, et al. Molecular detection ofPhytophthoracapsiciin infected plant tissues, soil and water[J]. Plant Pathology, 2006, 55(6): 770-775.

[13] Li S, Hartman G L. Molecular detection ofFusariumsolanif. sp.glycinesin soybean roots and soil[J]. Plant Pathology, 2003, 52(1): 74-83.

[14] 胡浩,殷幼平,張利平,等.柑桔黃龍病的常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測(cè)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(12):2491-2497.

[15] 姜廷波.利用PAPD-STS和實(shí)時(shí)定量PCR鑒別菠菜枯萎病原菌(Fusariumoxysporumf. sp.spinaciae)[J].植物病理學(xué)報(bào),2006,36(3):212-218.

(責(zé)任編輯：許晶晶)

Rapid Molecular Detection ofBotrytiscinereaby PCR

MA Zhong-wen

(Department of Biotechnology, Fujian Vocational College of Agriculture, Fuzhou 350303, China)

In order to develop a technique for the rapid detection ofBotrytiscinerea, we designed a pair of specific primers (TBCF/TBCR) forB.cinereaaccording to the sequence difference of internal transcribed spacer region (ITS) of the ribosomal gene, and used these primers to detectB.cinereathrough conventional PCR and nest-PCR. The results indicated that: under optimized reaction system and amplification conditions, only a single band (386 bp) of PCR product was amplified fromB.cinereathrough the primers TBCF/TBCR, and the other tested pathogens were negative. The detection sensitivity of conventional PCR for the genomic DNA ofB.cinereawas 100 pg/25 μL, while that of nest-PCR with the primers ITS1/ITS4 and TBCF/TBCR was 10 fg/25 μL. This constructed PCR detection method is characterized by strong specificity, high sensitivity, high accuracy, and easy and rapid operation, so it can be used to detectB.cinereain soil and diseased grape tissues.

Botrytiscinerea; ITS analysis; Specific primer; Molecular detection

2016-10-08

福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015JS001)。

馬仲文(1978—)，男，助教，碩士，主要從事食品微生物鑒定及其發(fā)酵技術(shù)研究。

S435.72

A

1001-8581(2017)02-0067-04