木薯渣堆肥過程中相關指標的變化及細菌群落特征

羅 佳,張 苗,嚴少華,張志勇,張振華*

(1.江蘇省農業科學院 六合動物科學基地,江蘇 南京 210014;2.江蘇省農業科學院 農業資源與環境研究所,江蘇 南京 210014)

木薯渣堆肥過程中相關指標的變化及細菌群落特征

羅 佳1,張 苗1,嚴少華1,張志勇2,張振華2*

(1.江蘇省農業科學院 六合動物科學基地,江蘇 南京 210014;2.江蘇省農業科學院 農業資源與環境研究所,江蘇 南京 210014)

利用條垛式堆肥對木薯渣進行40 d的發酵處理,并對發酵過程中溫度、碳氮比、種子發芽指數及細菌群落結構進行檢測。試驗結果表明：木薯渣可以直接進行堆肥發酵,在發酵3 d后堆體溫度即可達到50 ℃以上,高溫期持續1個月左右;經過40 d的發酵后堆體的碳氮比降至20以下;經不同發酵階段堆體處理的種子的發芽指數逐漸升高,最后升至87.4%。對堆體細菌菌群的高通量測序分析結果表明：堆體的細菌群落結構在堆肥發酵不同階段存在差異,在發酵前期部分細菌群落差異較大,在發酵后期細菌群落結構趨于穩定；在木薯渣堆體中存在大量與纖維素分解相關的Firmicutes門和Bacteroidetes門的菌群。

木薯渣;堆肥;指標；細菌；群落結構

近年來,我國每年產生有機固體廢棄物超過100多億t,其中大部分無法得到很好的利用,泛濫成災、垃圾圍城現象越來越嚴重,這些有機固體廢棄物已經成為日益嚴重的生態環境災難[1]。有機固體廢棄物含有大量的作物生長所需的氮、磷等營養元素[2]；如果無法得到合理利用，則這些營養元素將成為河流湖泊等水體和自然環境的污染源。當前有機固體廢棄物最方便的資源化利用途徑是制成有機肥。而大力發展有機固體廢棄物肥料化對于我國農業部推動的“減肥減藥”行動,2020年實現我國化肥使用量的零增長具有十分重要的意義。大量研究表明,長期施用有機肥可以改善土壤理化性質、提高農作物產量、增強土壤穩定性[3-5],同時對土壤中的C、N有固定作用,可以減少溫室氣體的排放[6-7]。

木薯渣是生產加工淀粉或乙醇后的副產品,每年我國產生的大量木薯渣資源無法獲得有效利用,這些廢棄物中含有大量的淀粉、木質纖維素(包括半纖維素、纖維素和木質素)以及少量氰化物,滯留于環境中,會污染水體和生活環境。目前國內對木薯渣的應用主要有:生產單細胞蛋白[8]；作為動物飼料[9]，但是因為木薯渣中含有一定量的氰化物等有毒物質[10],所以也限制了其用作動物尤其是單胃動物飼料;培養食用菌[11]。木薯渣中大部分物質為碳水化合物,有機物的含量達到90%以上(以干物計),含有較多的粗纖維,粗蛋白含量低,具有較高的碳氮比。但是上述途徑只能解決部分木薯渣的出路問題,還有大量的木薯渣得不到解決。本研究通過監測木薯渣條剁式堆肥發酵過程中理化性狀及微生物群落變化情況揭示木薯渣肥料化發酵動態參數,旨在為木薯渣肥料化利用提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗在江蘇省農業科學院六合動物科學基地有機肥場進行,木薯渣來自江蘇省灌南縣新冠酒業有限公司,其基本性狀為總氮1.94%、總磷0.26%、總鉀0.97%、有機質79%、pH 7.77、EC 4.9 ms/cm。試驗木薯渣重量為40 t,條剁式發酵,發酵堆長40.0 m,高1.2 m。采用翻拋機翻堆,每隔2 d翻堆一次。試驗周期為40 d。

1.2 樣品的采集與測定

溫度測定：每天9:00時測定堆溫,測量時將溫度計插入堆體表面30～40 cm處,測定堆體前、中和后3個不同位置的溫度,取其平均值作為當天堆體溫度；同時記錄周圍環境溫度。

樣品采集：每間隔10 d采集堆肥樣品一次,采集時用鐵鍬挖開堆體剖面,距離表層0～20 cm為外層,20～40 cm為中層,40 cm以上為內層,分層采集樣品,低溫冷凍保存。將外層、中層和內層樣品混合,做成3個混合樣品,分別采用常規方法[12]測定有機碳、總氮、總磷等常規指標。分層采集樣品(首次樣品未發酵，采集時不分層)5次，分別進行高通量測序分析，其中首次樣品編號為First;第二次采樣外層編號為Second-W,中層為Second-Z,內層為Second-N;第三次采樣外層為Third-W,中層為Third-Z,內層為Third-N;第四次采樣外層為Four-W,中層為Four-Z,內層為Four-N;第五次采樣外層為Five-W,中層為Five-Z,內層為Five-N。

種子發芽指數測定：將待測新鮮堆肥樣品與去離子水按照1 g∶10 mL的比例混合,震蕩1 h后,用移液管取10 mL提取液到鋪有濾紙的培養皿中,將20顆小青菜種子均勻地放入其中,在30 ℃下培養48 h，然后測定發芽率和根長,每處理重復3次,以去離子水為對照。按照以下公式計算種子發芽指數[13]:發芽指數=(處理組發芽率×處理組根長)/(空白組發芽率×空白組根長)×100%。

1.3 高通量測序分析

用于細菌高通量測序的堆肥樣品DNA采用引物Forward primer 5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′和Reverse primer 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′對細菌16S rRNA V4和V5區進行擴增。PCR反應程序為95 ℃ 2 min,94 ℃變性20 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環;最后72 ℃延伸2 min。取5 μL的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測合格后由上海天昊生物科技有限公司采用Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序和分析。進行高通量測序后,使用UPARSE軟件以97%為劃定閾值對16S rRNA序列劃分操作分類單元(OTU)。通過Microsoft Excel for Windows 2010軟件對OTU百分含量作圖分析。

1.4 數據的分析與統計

對試驗數據使用Excel 2010和SPSS統計分析軟件進行單因素方差分析,比較各組數據之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 木薯渣堆肥溫度的變化情況

溫度是堆肥腐熟效果分析的重要指標。經過連續40 d的監測,溫度變化情況見圖1,堆體開始溫度只有室溫17 ℃,經過快速升溫期后溫度在第3天上升至50 ℃以上,高溫期持續27 d后進入降溫期，溫度逐漸降低。堆肥溫度持續27 d超過50 ℃,能夠有效殺滅木薯渣中的病原菌、蟲卵及草籽,高溫期長度完全符合有機物料無害化處理標準[14]。

圖1 木薯渣堆肥過程中堆體溫度和環境溫度的變化

2.2 木薯渣不同堆肥階段碳氮比的變化

堆肥的碳氮比(C/N)被普遍認為是檢測堆肥腐熟的一個重要指標,通常認為C/N由堆肥初期的25～30下降到20以下為堆肥腐熟的主要標志[15]。如圖2所示,木薯渣初始C/N為25.91,十分適合堆肥發酵,能夠快速升溫;隨著堆肥發酵的進行,木薯渣堆體的C/N呈下降趨勢,10 d后C/N下降為23.5,40 d后C/N下降到20以下,表明木薯渣已經基本腐熟。

2.3 木薯渣不同階段的堆肥對種子發芽指數的影響

種子發芽指數是衡量堆肥產品質量和腐熟度的重要指標,也是間接表征堆肥的植物毒性的一個指標：當種子發芽指數>50%時,認為堆肥產品的植物毒性處于較低水平;當種子發芽指數>80%時,可認為堆肥處于完全腐熟狀態[16]。從圖3可以看出：木薯渣初始發酵時種子發芽指數為55.25%,之所以超過50%，是因為木薯渣本身為酒精發酵后的殘渣,具有較低水平的植物毒性；隨著堆肥發酵的進行，種子發芽指數呈上升趨勢,經過30 d的發酵，種子發芽指數已經接近80%,而到40 d時種子發芽指數已經達到87.4%,說明此時堆肥處于完全腐熟狀態。

圖2 木薯渣堆肥過程中堆體碳氮比的變化

圖3 木薯渣堆肥過程中種子發芽指數的變化

2.4 木薯渣不同堆肥階段細菌高通量測定分析

通過對木薯渣堆肥不同批次13個樣品16S rRNA V4和V5區的擴增測序,共獲得690735條有效序列,根據barcode標簽進行樣品序列拆分,在97%相似度下將獲得的序列進行物質分類的OTU分析,一共獲得2068個OTU,說明樣品中含有豐富的細菌。樣品中細菌數量占比超過1%的細菌主要來自Proteobacteria(變形菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)及Firmicutes(厚壁菌門);它們在綱水平上主要屬于Deltaproteobacteria(變形菌綱)、Planctomycetia(浮霉狀菌綱)、Sphingobacteriia、Acidobacteria(酸桿菌綱)、Gammaproteobacteria(γ-變形菌綱)、Anaerolineae(厭氧繩菌綱)、Clostridia(梭菌綱)、Cytophagia(噬纖維菌綱)等綱。

采用R語言制作熱點圖(heatmap),結果見圖4。由圖4可以看出堆肥樣品間與細菌間的網狀結構。樣本數據按照橫坐標聚類,即按照堆肥樣品聚類,堆肥樣品可以分為三大類：未發酵樣品First單獨為一類；后期堆肥樣品主要分為二類。樣本按照縱坐標聚類,即細菌在綱水平上的聚類,可以將細菌OTU量相關聚在一起,可以分為三大類：相對豐度高的為一類；相對豐度差的分為二類。

同時對樣品進行主成分分析(PCA),分析不同樣品OTU組成的差異,結果(圖5)表明：樣品First與其他樣品距離較遠,差異較大；樣品Second-W的細菌群落結構與樣品First最相似；樣品Second-Z、Third-Z和Third-N的細菌群落結構比較相似；樣品Third-W和Four-W的群落結構比較接近；樣品Four-Z、Four-N、Five-W、Five-Z、Five-N的群落結構比較接近；與初始樣品First群落結構差距最大的是樣品Third-Z和Third-N。說明木薯渣堆肥發酵過程中細菌群落結構變化逐漸加大,但在進入發酵末期后細菌群落結構趨于穩定。

3 討論

肥料化是解決目前日益劇增的有機固體廢棄物問題的主要途徑,堆肥發酵過程中最常用的衡量堆肥腐熟度的指標是溫度、碳氮比和種子發芽指數[17-18]。有機物料需要經過高溫腐熟才能形成有機肥,高溫腐熟過程不僅可以減少有機肥施用后燒苗的現象,同時也殺滅有機物料中大量的致病菌和寄生蟲[19]。堆肥腐熟需要經過升溫和降溫的過程,高溫階段是堆肥過程中的重要階段,堆肥溫度持續3 d超過55 ℃將殺死堆體中的大部分病原菌[13]。雖然碳氮比在一定程度上可以指示堆肥的腐熟度,但是對于本身碳氮比比較低的物料不適用,不適合用于衡量工廠化堆肥的腐熟度[15]。種子發芽指數是一種可靠性較好、可以衡量堆肥產品質量和腐熟度的重要指標,被廣泛應用[20]。本研究測定木薯渣堆肥發酵過程中溫度、碳氮比和種子發芽指數,發現經過40 d的發酵后木薯渣完全腐熟。

堆肥的腐熟過程與微生物的降解活動密切相關,細菌是堆肥過程中數量最多的微生物群落,在堆肥發酵過程中起到十分重要的作用。相關研究表明堆肥中細菌數量一般呈現高-低-高的趨勢[20]或者低-高的趨勢[21],這種變化差異可能與堆肥過程中升溫速度和檢測時間有關系[22]。目前,大量的細菌菌群在堆肥中被檢測出來,例如Blanc M等[23]通過分子生物學方法在堆肥中發現了大量的Thermusthermophilus、Bacillusspp.、Hydrogenobacterspp.； Garcia R等[24]從堆肥中分類出多種硫氧化細菌；Actinobacteria、γ-Proteobacteria、Xanthomonascampestris、Pseudomonas、Lactobacillus、Paracoccusthiocyanatus等細菌均在堆肥發酵過程中被發現[25-27]。本研究通過高通量測序發現堆肥中存在大量的不同種類細菌,主要屬于Proteobacteria(變形菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)及Firmicutes(厚壁菌門)等門。相關研究表明： Firmicutes門的微生物可以利用胞外酶分解纖維素、半纖維素和木質素,并且還可以水解糖和蛋白質,產生各種酸、醇和脂類; Bacteroidetes門的部分微生物可以分解纖維素、半纖維素和木質素[15]。本研究檢測出Firmicutes門和Bacteroidetes門的細菌占優勢,這可能與木薯渣發酵過程中纖維素的降解過程有關。

在堆肥過程中有大量的微生物參與其中,微生物的種類繁多,甚至在堆肥的不同原料、不同時期和堆體的不同深處微生物種類也存在較大的差異。劉健斌等[22]研究表明污泥高溫堆肥過程中不同時期細菌群落結構差異明顯,高溫菌群和常溫菌群交替變化。李鳳等[28]比較了農業廢棄物與城市餐廚垃圾堆肥之間微生物的差異,結果顯示兩者在優勢菌群上存在Bacillusmegaterium和Phanerochaetechrysosporium兩個相同的菌群,但是另有大部分菌群是兩者各自獨有的優勢菌群。本研究對不同時期不同部分的堆肥樣品進行高通量測試,發現堆體初始樣品的細菌群落與發酵后樣品存在很大差異,而且發酵前期樣品和發酵后期樣品的細菌群落也存在差異;發酵前期在堆體內層、中層、外層細菌群落差異較大,發酵后期堆體內層、中層、外層細菌群落差異較小。

綜上所述,木薯渣可以直接進行堆肥發酵,在發酵過程中堆體經過升溫、高溫期和降溫過程,堆體的碳氮比逐漸降低,經堆體處理后種子的發芽指數逐漸升高,最終形成腐熟的有機肥。細菌群落結構在木薯渣堆肥發酵不同階段存在差異,在發酵前期堆體部分細菌群落差異較大,在發酵后期細菌群落結構趨于穩定且變化較小。

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(責任編輯:黃榮華)

Related Index Changes and Bacterial Community Characteristics in Composting Process of Cassava Residue

LUO Jia1, ZHANG Miao1, YAN Shao-hua1, ZHANG Zhi-yong2, ZHANG Zhen-hua2*

(1. Luhe Animal Science Station, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. Institute of Agricultural Resources and Environmental Sciences, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

In this study, the composting of cassava residue was carried out through 40-d windrow fermentation, and the fermentation temperature, C-N ratio, seed germination index, and bacterial community structure in the composting process were detected. The results showed that: cassava residue could be directly used for compost fermentation, the compost temperature rose to more than 50 ℃ after 3-d fermentation, and the high temperature lasted for about 1 month; the C-N ratio of the compost reduced to below 20 after 40-d fermentation; the germination index of seeds treated with the solution of the compost at different fermentation stages increased gradually, and finally rose to 87.4%. The high-throughput sequencing analysis showed that the bacterial community structure of cassava residue compost was different at various fermentation stages, and some bacterial communities changes greatly in the earlier fermentation period, but all bacterial communities had little changes in the later fermentation period. There were a large number of bacteria belonged to Firmicutes and Bacteroidetesas in the cassava residue compost, which were related to the decomposition of cellulose.

Cassava residue; Compost; Index; Bacteria; Community structure

2016-10-16

公益性行業(農業)科研專項(201203050-6);江蘇省自主創新基金[CX(14)2132];江蘇省六大人才高峰項目(NY-033)。作者簡介：羅佳(1982─),男,江蘇濱海人,博士,主要從事污染物治理及資源化利用研究。*通訊作者:張振華。

S141.4

A

1001-8581(2017)02-0058-05