基于SSR標記的李種質資源遺傳多樣性研究

孫 萍,林賢銳,沈建生

(浙江省金華市農業(yè)科學研究院,浙江 金華 321000)

基于SSR標記的李種質資源遺傳多樣性研究

孫 萍,林賢銳,沈建生*

(浙江省金華市農業(yè)科學研究院,浙江 金華 321000)

利用13對SSR引物對47份李種質資源進行了遺傳多樣性分析，結果表明：13對引物在47個樣品中的平均等位基因數(shù)(Na)為10.846,有效等位基因數(shù)(Ne)平均值為4.806,觀察雜合度(Ho)平均值為0.746,平均期望雜合度(He)為0.774, Shannon多樣性指數(shù)(I)平均值為1.817，說明供試的李種質資源具有較高的遺傳多樣性。基于Nei距離的Neighbor-Joining聚類分析結果表明：47個李樣品被分為3個組,同時能夠清楚地鑒別出同物異名的種質資源。基于貝葉斯方法的STRUCTURE聚類分析進一步證實了這一結果。表明日本和美國的李品種與我國南方李品種群親緣關系較近。

李;種質資源； SSR標記;遺傳多樣性;遺傳結構

李是薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬(Prunus)植物。在全世界被大多數(shù)分類學家所認可的李屬植物有30個多種；我國現(xiàn)有8個種、5個變種、800余個品種和類型,這些種由自然狀態(tài)下的二倍體和六倍體組成。目前商品生產(chǎn)的李常被分為中國李(P.salicina,又稱為日本李)[1]和歐洲李(P.domestica)兩大類；中國李起源于我國長江流域,多數(shù)為二倍體,世界上絕大多數(shù)鮮食栽培李品種都是中國李或與中國李有親緣關系。大多數(shù)歐洲李為六倍體[2]。在世界范圍內李的栽培種和品種極多,而我國是李的起源地之一,是李種質遺傳多樣性中心,有著非常豐富的李種質資源[3]。由于李品種豐富以及具有異花授粉特性,種屬間(滲透)雜交普遍,中間類型多,種的界限不清楚,再加上長期在不同地區(qū)之間的引種,常出現(xiàn)同名異種或同種異名的現(xiàn)象,給種質資源的保存、育種和利用帶來極大不便[4]。

在通常情況下,李栽培種或品種的鑒別主要依靠比較植株的葉片、花和果實等形態(tài)特征來實現(xiàn)[5-8]。通過表型性狀進行種質區(qū)分的方法需要大量的田間觀察,對表型特征的描述和記錄工作強度大,費時費力,能夠提供的有效辨識信息卻非常有限。李的一些表型性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀,容易受到環(huán)境因素和植株生長階段的影響,不能很好地反映真實的遺傳背景。另外,李屬植物不存在種間雜交障礙,種間雜交產(chǎn)生的基因漸滲會導致不同種或品種表型性狀的趨同性[9-10],造成種或品種的混淆。后來發(fā)展的同工酶、花粉微觀形態(tài)以及染色體核型等方法也同樣面臨諸多問題[11-13]。

SSR標記具有等位基因變異多、信息含量高、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、重復性好、共顯性遺傳、特異性強、種屬間有良好的通用性等優(yōu)點[14]。因此SSR標記在果樹種質資源鑒定、親緣關系分析、遺傳多樣性評價等方面已成為應用最為廣泛的分子標記[15-18]。Dirlewanger等[19]的研究結果表明,蘋果、杏、櫻桃、桃、李等薔薇科果樹的SSR標記存在明顯的共線性。桃等薔薇科果樹中已開發(fā)出大量的SSR引物,為李SSR引物的開發(fā)提供了十分有用的參考。前人的研究結果[20-21]表明桃的SSR標記可以被成功地轉移到李上,這為李SSR標記的選擇提供了參考。Horvath等[22]利用SSR標記手段對歐洲李、櫻桃李及黑刺李的遺傳結構進行了分析,可以很清晰地區(qū)分這3個物種,這為不同李子品種的起源研究提供了科學的依據(jù)。Carrasco等[23]基于SSR標記對中國李的遺傳多樣性進行了研究,研究結果對李種質資源的管理和保護有重要的意義。另外Mnejja等[24]利用中國李的基因組文庫開發(fā)了新的SSR引物,這為李種質資源的遺傳分析提供了方便。

筆者在前人研究的基礎上,進一步篩選了適合李基因組的SSR標記,并利用篩選的SSR標記對主要李品種(或類型)進行了遺傳多樣性分析和品種鑒別,旨在為李育種、種質保存與利用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試李材料共47份,于春季采自浙江省金華市農科院試驗基地的李品種園,詳見表1。采集健康幼嫩葉片分別置于有編號的采集袋內,用變色硅膠迅速干燥,帶回實驗室,用于DNA的提取。

表1 供試李材料及其來源

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB法[25]從用硅膠干燥的李葉片中提取總DNA,稀釋到10～30 ng/μL,儲存在-20 ℃。

1.2.2 SSR標記的篩選 隨機抽取8個樣品DNA模板用56對SSR引物進行擴增,將擴增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上以60 W恒壓電泳約2.5 h,電泳后銀染顯色，用Bio-RadGelDoc2000凝膠成像儀(Bio-RadLaboratories, Hercules, CA, USA)拍照記錄。從56對SSR引物中篩選出13對擴增條帶清晰、穩(wěn)定的引物，進行SSR擴增,結果詳見表2。為了實現(xiàn)微衛(wèi)星多態(tài)性的熒光半自動檢測,在試驗前必須對篩選好的引物進行熒光修飾,在單向引物的5′端(或3′端)加上熒光修飾基團；熒光引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

PCR反應體系為：10×PCR buffer (Mg2+) 2 μL、2 mmol/L dNTP 1 μL、0.5 U rTaq聚合酶0.1 μL、濃度為10 μmol/L的正反向引物各0.25 μL、20 mg/L DNA模板1 μL。使用Eppendorf Mastercycler進行DNA擴增。擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s,50～60 ℃退火40 s,72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min,在4 ℃下保存。對PCR產(chǎn)物用滅菌后的雙蒸水稀釋100～200倍,在ABI 3130測序儀上進行毛細管電泳檢測,用Gene Mapper 4.0對電泳結果在60～350 bp片段大小范圍內進行數(shù)據(jù)采集。

表2 SSR引物及其擴增的長度范圍

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測序結果導入軟件Genetic Profile v 1.0(Molecular Dynamics),參照峰值強度及分子內標的大小,確定微衛(wèi)星位點擴增片段的區(qū)間,對片段大小進行統(tǒng)計;對于出現(xiàn)多峰型的樣品,重新進行PCR試驗后再確定其片段大小;將統(tǒng)計結果保存為EXCEL格式，以備后續(xù)分析之用。

利用遺傳數(shù)據(jù)分析軟件GenAlEx 6.3[28]計算多態(tài)性等位基因數(shù)(Na)、SSR位點的有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、固定指數(shù)(F)及Shannon多樣性指數(shù)(I)等遺傳多樣性指標。

用軟件POPULATION 1.2[29]基于Nei的遺傳距離對47個李品種進行Neighbor-Joining 聚類分析,并利用軟件DENDROSCOPE 3[30]描繪和修改聚類圖。

另外用一種貝葉斯聚類方法[31]反映群體的遺傳結構并確定最佳的群體分組,這種方法用STRUCTURE version 2.3.3軟件完成。首先設定K=1～5,設定Burn-in周期為100000,MCMC的重復次數(shù)為100000次,采用混合模型和相關等位基因頻率,對不同的K值進行10次重復運行,然后將后綴為“_f”的結果文件壓縮,上傳到“STRUCTURE HARVESTER”網(wǎng)站(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/),通過deltaK確定最佳K值[32]。

2 結果與分析

2.1 SSR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

13對引物在47個樣品中的多態(tài)性等位基因數(shù)(Na)從6～17不等,平均等位基因數(shù)為10.846(表3),其中引物UDP98-025擴增出的等位基因數(shù)最少(6個),引物CPPCT022擴增出的等位基因數(shù)最多(17個)。每個樣品每對引物產(chǎn)生1個或2個等位基因,有效等位基因數(shù)(Ne)范圍為3.130(引物CPPCT026)～7.808(BPPCT038),平均值為4.806。

從表3還可以看出： SSR位點的觀察雜合度(Ho)為0.457(CPPCT026)～0.891(UDP98-025),平均值為0.746；期望雜合度(He)為0.681(CPPCT026)～0.872(BPPCT038),平均值為0.774； Shannon多樣性指數(shù)(I)為1.401(UDP98-025)～2.386(BPPCT038),平均值為1.817。這些結果說明供試李材料的遺傳變異程度較高,具有較高的遺傳多樣性。

2.2 聚類分析

2.2.1 Neighbor-Joining聚類分析 從圖1可以得出:47個李地方品種被分為3組,第Ⅰ組包括23個品種,其中品種15表現(xiàn)特殊,獨立成為第一亞組,2、3、1、4等9個品種組成第二亞組,其余13個品種視為第三亞組;第Ⅱ組包括14個品種,被分為兩個亞組,在第一亞組中包括來自美國、日本的6個品種,第二亞組中包括杏李雜交種在內的8個品種;其余10個品種聚在第Ⅲ組中,主要包括來自中國遼寧、美國等的李品種。在所供試的47個樣品中,品種45與46、35與36、38與39，以及27與28的遺傳一致度為1；品種13與14、19與20的遺傳一致度為0.99；樣品5與7的遺傳一致度為0.95(數(shù)據(jù)未列出)。

表3 47個栽培李類型13對引物的遺傳參數(shù)

圖1 基于Nei的遺傳距離的Neighbor-Joining聚類分析結果

2.2.2 貝葉斯聚類分析 將47個李地方品種的K值設為1～10，進行貝葉斯遺傳分析,運行10次重復后發(fā)現(xiàn)最適K值為3(圖2)。

使用STRUCTURE軟件得到了與Neighbor-Joining聚類分析相似的結果,根據(jù)DeltaK確定最佳類群數(shù)為K=3。如圖3所示,在K=3的情況下,將47個樣品分為3組,品種4、1、3、2等9個供試樣品以紅色為主，視為第一組,與N-J聚類分析結果中的第一組中的第一亞組一致;以綠色為主的12個供試樣品組成第二組,與N-J聚類分析結果中的第一組中的第二亞組基本一致;其余的26個樣品為第三組。其中部分樣品表現(xiàn)為2個或3個基因池的混合。

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

等位基因數(shù)和雜合度是反映所用SSR位點鑒別植物基因型能力的2個重要指標。13對引物在47個樣品中平均等位基因數(shù)為10.846,有效等位基因數(shù)(Ne)平均值為4.806,觀察雜合度(Ho)平均值為0.746,平均期望雜合度(He)為0.774,比Basilio Carrasco等[33]在29個日本李品種中得到的結果(Na=12.1,Ne=5.2,Ho=0.9,He=0.8)低,但顯著高于Ahmad、Mnejja等在李資源上的研究結果(Na=4.3[34]；Na=5.7,Ho=0.73[35])。同時本研究中李種質資源的遺傳多樣性水平明顯高于桃[36](Na=6.6～7.3,Ho=0.35,He=0.5～0.55)、扁桃[37](Na=8.8,Ho=0.7,He=0.79)、杏[38](Na=3.5,Ho=0.58)、櫻桃[39](Na=3.5～6.0,He=0.49～0.66)等其他李屬植物的,說明供試的李種質資源具有較高的遺傳多樣性水平。這為李種質資源圃的建立奠定了基礎。

圖2 STRUCTURE分析得出的最適K值

圖3 用STRUCTURE計算的K=3時的李樣品分組情況

3.2 遺傳結構分析

基于Nei距離的Neighbor-Joining聚類分析以及基于貝葉斯方法的STRUCTURE聚類分析,均清楚地檢測到李供試樣品的遺傳結構:47個李樣品被分為3個組。其中早美麗、紅美麗、井上、加拿大等品種聚在一起,它們在生產(chǎn)上的性狀相似,成熟期、單果重較為接近,說明它們的親緣關系較近;采集于浙江及附近省市的浦江桃形李、芙蓉李、黃心李、紅心李、槜李、天目山李、松山李、中山李以及來自日本的秋姬李、美國的安格洛聚在一起,說明日本和美國的李品種與我國南方李品種群親緣關系較近,進一步證實了日本李是從我國南方引進中國李的種質,并進而傳到美國等世界各地,這與劉威生等[41]的研究結果一致。

在種質資源圃的建立過程中鑒定、剔除重復樣品,可以節(jié)約種質資源保存的土地、資金和時間,從而使種質資源圃管理者集中精力進行特異的、多樣的和有價值的種質的鑒定、評價、更新復壯等工作。SSR分析能有效地區(qū)分重復收集品、鑒別同名異物和同物異名的種質資源。從Neighbor-Joining聚類圖中可以清晰地看到浦江桃形李1和浦江桃形李2、芙蓉李與16號的遺傳一致度為1,說明這兩對材料是重復收集品;美藍寶石與皇家寶石這兩種材料從植物學形態(tài)上看很難區(qū)分,遺傳一致度為1,說明它們之間存在著同物異名的現(xiàn)象;品種李王與變異李王、松山李與中山李、蜜思李與其芽變品種6-5早熟之間的遺傳一致度分別為0.99、0.99、0.95,說明用SSR技術檢測李種質資源時對基因組DNA差異的靈敏性較高,因此SSR標記是可以用于李種質資源鑒定、評價的優(yōu)良標記。另外,根據(jù)遺傳學獲得的資料和證據(jù)可以幫助制定合理的管理措施和有效的保護策略。從STRUCTURE分析圖中可以看到6-5早熟芽變品種、浦江桃形李、天目山李、松山李、秋姬李、安格洛、桂林李等李品種表現(xiàn)出了3個基因庫的混合,應在以后的研究中加以關注和保護。

本研究采用兩種方法分析了李種質資源的遺傳結構,由于不同的分析方法所提供的信息量不同，導致兩種不同的分析方法所得到的結果并不完全一致,例如在Neighbor-Joining聚類圖中品種‘玫瑰’表現(xiàn)出特異性，單獨聚成一個亞組,而在貝葉斯聚類分析中這個品種沒有表現(xiàn)出特異性。這兩種方法各有特點,聚類分析能夠量化地體現(xiàn)出品種間的差異,而貝葉斯分析能更直觀地揭示品種間的來源差異,因此將這兩種方法結合起來進行分析,可以相互驗證、相互補充,更能充分地揭示出品種間的遺傳關系和遺傳多樣性。

然而本研究聚類結果不能將國外品種與地方品種(品系)明顯分開,大多數(shù)的美國李品種和日本李品種與我國南方李品種的親緣關系較近,初步說明國外的中國李品種可能是從我國南方地區(qū)引進,然后選育而來的。因此,今后仍需全面收集國內外李品種,特別是日本、美國和我國南方地區(qū)的李品種,結合SSR等分子標記方法進行進一步的研究。

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(責任編輯:黃榮華)

Study on Genetic Diversity of Plum Germplasm Resources Based on SSR Markers

SUN Ping, LIN Xian-rui, SHEN Jian-sheng*

(Jinhua Academy of Agricultural Sciences in Zhejiang Province, Jinhua 321000, China)

Thirteen pairs of SSR (Simple Sequence Repeats) primers were used to evaluate the genetic diversity of 47 accessions of plum germplasm resources. The results showed that the mean number of polymorphic alleles (Na) was 10.846, the number of effective alleles (Ne) per locus was 4.806, the average observed heterozygosity (Ho) was 0.746, the average expected heterozygosity (He) was 0.774, and the mean Shannon’s diversity index (I) was 1.817, suggesting the tested plum germplasm resources had a high genetic diversity. Neighbor-Joining clustering analysis based on Nei’s distance indicated that 47 plum samples were divided into 3 groups, and the synonyms of these germplasm resources could be identified clearly, which was similar to the results of STRUCTURE clustering analysis based on Bayesian method. It was concluded that the plum germplasm resources from Japan and USA had a closer phylogenetic relationship with those from the Southern China.

Plum; Germplasm resource; SSR marker; Genetic diversity; Genetic structure

2016-09-26

浙江省公益技術研究農業(yè)項目(2013C32024)。

孫萍(1986─),女,農藝師,碩士,主要從事果樹種質資源的遺傳多樣性研究。*通訊作者：沈建生。

S662.3

A

1001-8581(2017)02-0033-07