高金蘋(píng),張紹菊,羅志紅,李津
長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT1對(duì)人宮頸癌XB1702細(xì)胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影響
高金蘋(píng),張紹菊,羅志紅,李津
目的探討長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(lncRNA)結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 1(CCAT1)對(duì)宮頸癌 XB1702 細(xì)胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影響。
方法通過(guò)電穿孔法分別將 CCAT1 siRNA 和重組表達(dá)載體 pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染人宮頸癌 XB1702 細(xì)胞后,G418 篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,實(shí)驗(yàn)分為 3 組:CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染 48 h 后,RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中 CCAT1 lncRNA 表達(dá)水平;CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖,TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡影響;裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)和下調(diào) RNA CCAT1 表達(dá)聯(lián)合 X射線照射對(duì)宮頸癌的生長(zhǎng)抑制作用。
結(jié)果干擾 XB1702 細(xì)胞中 CCAT1 lncRNA 表達(dá)后,XB1702 細(xì)胞增殖被抑制,細(xì)胞凋亡率增加;裸鼠移植瘤平均體積明顯小于對(duì)照組(正常 XB1702 細(xì)胞種植組)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);上調(diào) XB1702 細(xì)胞中 CCAT1 lncRNA 表達(dá)后,XB1702 細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng),細(xì)胞凋亡率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),而上調(diào)組裸鼠皮下種植瘤平均體積較照射前無(wú)明顯變化。
結(jié)論下調(diào) CCAT1 mRNA 表達(dá)能抑制人宮頸癌 XB1702細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng),增強(qiáng)瘤體的放射敏感性。
宮頸腫瘤; 腫瘤移植; 小鼠,裸; XB1702細(xì)胞; 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA
宮頸癌是一種嚴(yán)重威脅女性生殖健康的疾病,全世界每年有近 13 萬(wàn)女性被確診為宮頸癌患者[1-3]。臨床上宮頸癌患者由于術(shù)后存在高危因素或局部腫瘤過(guò)大常需要進(jìn)行放療,增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性尤為重要[4-6]。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(lncRNA)是近年來(lái)研究的一大熱點(diǎn)。研究表明,結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 1(CCAT1)在結(jié)腸癌組織中表達(dá)異常[7-9]。
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡健康 BALB/c 裸鼠36只,體重 100 ~ 120 g,均為雄性,由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。室溫 25 ℃,濕度 50% ~80%,SPF 環(huán)境下自由飲水和采食。
1.1.2 儀器和試劑 DMEM 完全培養(yǎng)基中包含2 mmol/L L-谷氨酞胺、10% FBS、1 mmol/L 丙酮酸鈉、100 mg/ml 青霉素鏈霉素二抗;BCA 蛋白濃度測(cè)試試劑盒(增強(qiáng)型)、5 × SDS 蛋白上樣緩沖液、20 × TBS 緩沖液等購(gòu)自南京建成生物工程研究所;胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司;PBS 磷酸緩沖液購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)HeraesSepatech 公司;Trizol 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷慕⒓胺纸M 將凍存的宮頸癌XB1702 細(xì)胞置于 60 ℃ 恒溫水浴箱,30 s 內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的快速?gòu)?fù)蘇。細(xì)胞液融化后迅疾轉(zhuǎn)入 EP 管并加入 DMEM 培養(yǎng)基,重復(fù)小心吹打細(xì)胞使其均勻分布,隨后離心棄上清液。將復(fù)蘇后的細(xì)胞用LG-DMEM 完全培養(yǎng)基調(diào)整為 1 × 106個(gè)/ml 的密度進(jìn)行培養(yǎng)。
將培養(yǎng) 24 h 的細(xì)胞取出,分為 3 組,分別為CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。
1.2.2 基因轉(zhuǎn)染 CCAT1 siRNA 和重組真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-CCAT1 分別由上海生工生物工程有限公司合成。用 HeBS 液[140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、0.75 mmol/L Na2HPO4、6 mmol/L 葡萄糖、25 mmol/L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸]重懸計(jì)數(shù);調(diào)整細(xì)胞密度約為 5 ×106個(gè)/ml,每次取 200 μl細(xì)胞懸液加入電擊杯,分別向三個(gè)處理組加入 4 μg CCAT1 siRNA、生理鹽水、pcDNA3.1-CCAT1,電擊后室溫靜置 2 min,然后分別加入培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。G418 篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系后,將其擴(kuò)大培養(yǎng)。
隨機(jī)選取首都醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等專業(yè)60名學(xué)生作為研究對(duì)象,將60名學(xué)生分為10個(gè)小組,每組5~7人。
1.2.3 RT-PCR 檢測(cè) CCAT1 lncRNA 表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后,取出細(xì)胞,離心棄上清收集細(xì)胞。基因相對(duì)表達(dá)水平采用 RT-PCR 進(jìn)行測(cè)定。通過(guò) Primer Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物,CCAT1 引物序列上游:5' CCAATTGAACCGAGCCTTGT 3';下游:5' TCGT GAGCGTTTTCGCAATG 3',目的片段長(zhǎng)度 298 bp。參照物 GAPDH 引物序列上游:5' TCCTCTGACT TCAACAGCGACAC 3';下游5' TCTCTCTTCCTCT TGTGCTCTTGC 3',片段長(zhǎng)度為 176 bp。反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳并成像儀攝片,用 Image proplus6.0圖像分析軟件測(cè)算電泳條帶的 OD 值,進(jìn)而計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。
1.2.4 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 人宮頸癌XB1702 細(xì)胞經(jīng)過(guò) CCAT1 siRNA 和重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng),CCK8 法測(cè)定培養(yǎng) 48 h 后細(xì)胞的增殖活化能力。具體方法為轉(zhuǎn)染 48 h 之后,將3 組細(xì)胞分別收集接種到 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,每組 3 個(gè)重復(fù);細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng) 48 h,向各孔中分別加入 20 μl CCK8 稀釋液,振蕩細(xì)胞板后繼續(xù)培養(yǎng) 1 h,用酶標(biāo)儀在 490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD)。
1.2.5 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡影響 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h 后,輕輕吹打細(xì)胞,使之均勻分布。PBS 磷酸緩沖液洗滌,洗滌后滴加原位末端標(biāo)記反應(yīng)混合液 50 μl,在濕盒中 37 ℃ 孵育 1 h,滴加 POD2轉(zhuǎn)化液 50 μl,濕盒 37 ℃ 孵育 30 min,pH 7.4 的磷酸緩沖液沖洗 3 次,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,HE 復(fù)染,顯微鏡下分析圖像。棕黃色細(xì)胞核的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù),計(jì)算細(xì)胞凋亡率。
1.2.6 檢測(cè) RNA CCAT1 表達(dá)聯(lián)合 X 射線照射對(duì)宮頸癌的生長(zhǎng)抑制作用 選取 36 只裸鼠隨機(jī)平均分三組,CCAT1 基因沉默組、CCAT1 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。分別取轉(zhuǎn)染培養(yǎng) 48 h后的各組細(xì)胞胰酶消化重懸,將之分別接種于相應(yīng)組裸鼠右腋皮下 0.5 cm 處。裸鼠在無(wú)菌、通風(fēng)、潔凈的 SPF 級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng),接種后 1 周左右,在裸鼠的接種區(qū)出現(xiàn)米粒大小的移植瘤。各組分別挑取 4 只裸鼠處死并分離腫瘤組織后,計(jì)算放射前腫瘤瘤塊體積。其余各組裸鼠麻醉處理,將之固定于解剖板上,進(jìn)行放療處理。放療處理后第 40 天進(jìn)行放療后腫瘤瘤塊體積的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行 3 次。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
本實(shí)驗(yàn)使用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)至少重復(fù) 3 次,所有數(shù)據(jù)以?±s 表示,組間比較采用單因素方差分析,移植瘤體積數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用重復(fù)測(cè)量方差分析,并作多重比較,以 P < 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 CCAT1 lncRNA 的表達(dá)
圖 1 為 CCAT1 基因修飾轉(zhuǎn)染后宮頸癌XB1702 細(xì)胞中 CCAT1 基因相對(duì)表達(dá)水平。與空白對(duì)照組相比,CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組顯著降低了宮頸癌 XB1702 細(xì)胞中該基因 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平(P < 0.05),而 CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染明顯提高了宮頸癌細(xì)胞中 CCAT1 基因的相對(duì)表達(dá)水平(P < 0.05)(圖 1B),提示基因轉(zhuǎn)染成功。
2.2 細(xì)胞的增殖能力
如圖 2 所示,pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染組的XB1702 細(xì)胞增殖活性顯著高于空白對(duì)照組和基因沉默組(P < 0.05),與對(duì)照組和 pcDNA3.1-CCAT1轉(zhuǎn)染組相比,CCAT1 siRNA 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力明顯降低(P < 0.05)。與對(duì)照組相比較,基因沉默組和基因重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖活性分別降低和提高了 36% 和 19%。
2.3 細(xì)胞凋亡
對(duì)照組、基因沉默組和基因重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中,宮頸癌 XB1702 細(xì)胞凋亡率分別為 8.6%、15.4% 和 5.3%。其中基因沉默組最高,顯著高于其他兩組;與空白對(duì)照組相比,pcDNA3.1-CCAT1轉(zhuǎn)染組的宮頸癌 XB1702 細(xì)胞凋亡率顯著降低(P < 0.05)(圖 3)。

圖 1 CCAT1 基因修飾轉(zhuǎn)染后宮頸癌 XB1702 細(xì)胞中 CCAT1 基因相對(duì)表達(dá)水平(A:各組 CCAT1 lncRNA 的電泳圖;B:各組 CCAT1 lncRNA 的表達(dá)水平)Figure 1 Relative expression of CCAT1 gene in cervical cancer XB1702 cells transfected with CCAT1 gene (A: Electrophoregram of each group of CCAT1 lncRNA; B: Expression level of CCATl lncRNA in each group)

圖 2 CCAT1 基因?qū)m頸癌 XB1702 細(xì)胞增殖活性的影響Figure 2 Effect of CCAT1 gene on the proliferation of cervical cancer XB1702 cells

圖 3 CCAT1 基因?qū)m頸癌 XB1702 細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of CCAT1 gene on the apoptosis of cervical cancer XB1702 cells
2.4 對(duì)宮頸癌的生長(zhǎng)抑制作用的影響
CCAT1 siRNA轉(zhuǎn)染組裸鼠移植瘤平均體積明顯小于對(duì)照組(P < 0.05),上調(diào) XB1702 細(xì)胞中CCAT1 lncRNA 表達(dá)后,XB1702 細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng),細(xì)胞凋亡率降低(P < 0.05),而pcDNA3.1-CCAT1 轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下種植瘤平均體積較照射前無(wú)明顯變化(表 1)。把治療前和治療后看做兩次重復(fù)測(cè)量,F(xiàn) = 19.55,P < 0.01,兩兩比較均 P < 0.01。

表 1 放療前后各組宮頸癌的生長(zhǎng)抑制作用的影響(cm3)Table 1 Inhibitory effect of radiotherapy on cervical cancer growth (cm3)
盡管長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 不具有其他編碼 RNA翻譯蛋白質(zhì)的功能,但因其具有獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu),并可定位于胞核或者胞質(zhì);其具有復(fù)雜的生物學(xué)功能,如參與染色質(zhì)重構(gòu)、RNA 剪接等[12]。其作用機(jī)制主要包括:①募集染色質(zhì)修飾酶復(fù)合物及目標(biāo)基因區(qū)域,參與靶基因染色質(zhì)的表觀遺傳學(xué)修飾;②根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,參與 mRNA 前體修飾和剪接等;③可作為分子支架,不同結(jié)構(gòu)域可結(jié)合不同的蛋白質(zhì)復(fù)合體,從而引導(dǎo)相關(guān)的大分子復(fù)合體在目標(biāo)區(qū)域組裝以協(xié)同發(fā)揮調(diào)控作用;④作為誘餌分子與蛋白質(zhì)或 miRNA 結(jié)合,調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[13-16]。正常細(xì)胞中,只有肝臟細(xì)胞和小腸細(xì)胞可以檢測(cè)到微量的 CCAT1,而其他細(xì)胞則檢測(cè)不到該基因表達(dá)。本試驗(yàn)在進(jìn)行 CCAT1 siRNA 和PcDNA3.1-CCAT1 基因轉(zhuǎn)染后,CCAT1 的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。基因沉默組 CCAT1 基因表達(dá)水平顯著下降;而基因重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 CCAT1 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平顯著提高,提示本試驗(yàn)基因成功轉(zhuǎn)染。
通過(guò)轉(zhuǎn)染 CCAT1 siRNA 質(zhì)粒,下調(diào)了該基因在宮頸癌細(xì)胞中的基因表達(dá),進(jìn)而提高了癌細(xì)胞的放射敏感性。在進(jìn)行放射治療時(shí),移植瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展水平明顯得到了抑制。然而,目前就 CCAT1基因與宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性之間關(guān)系的研究還是空白。有研究表明,c-MYC 基因表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的放射敏感性呈高度正相關(guān)。因此,CCAT1 參與調(diào)控的 c-MYC 基因轉(zhuǎn)錄也可能是改變細(xì)胞敏感性的原因之一,但其機(jī)制上需進(jìn)一步證明。本試驗(yàn)在上調(diào) CCAT1 的基因表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn),與放射治療之前相比,裸鼠的移植瘤無(wú)明顯改變,這一結(jié)果與對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
研究結(jié)果提示,CCAT1 可能是決定宮頸癌XB1702 細(xì)胞的關(guān)鍵基因。其上調(diào)的表達(dá)水平會(huì)使癌細(xì)胞喪失放射敏感性。由于長(zhǎng)鏈非編碼基因CCAT1 在宮頸癌細(xì)胞中的研究較少,因此本研究首次探究了 CCAT1 基因與宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡和移植瘤生長(zhǎng)發(fā)展的關(guān)系。研究顯示,下調(diào)宮頸癌細(xì)胞中的 CCAT1 基因可以明顯抑制癌細(xì)胞的增殖,抑制腫瘤的生長(zhǎng)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,長(zhǎng)鏈非編碼基因干預(yù)可能會(huì)為治療宮頸癌提供新策略。
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Impact of long non-coding RNA CCAT1 on the tumor sensitivity to radiotherapy in nude mice transplanted with human cervical cancer cells XB1702
GAO Jin-ping, ZHANG Shao-ju, LUO Zhi-hong, LI Jin
ObjectiveTo investigate the effect of long non-coding RNA (lnRNA) CCAT1 on the tumor sensitivity to radiotherapy in nude mice transplanted with human cervical cancer cells XB1702.MethodsThe human cervical cancer XB1702 cells were divided into 3 groups: control group, CCAT1 siRNA group and pcDNA3.1-CCAT1 group. The CCAT1 siRNA and pcDNA3.1-CCAT1 were transfected into the human cervical cancer cells XB1702 by the electroporation method and stable transfected cell line was selected and identified by the G418 method. After 48 h of transplantation, the expression levels of CCAT1 lnRNA were measured by RT-PCR. Cellular proliferation was tested by CCK8 method, and apoptosis were determined by the TUNEL technology. The development of human cervical tumors in the nude mice xenograft model was studied by up-regulating and down-regulating the CCAT1 expression in the cells combined with the X-ray irradiation.ResultsInterference of CCAT1 lnRNA expression in XB1702 cells significantly inhibited the cellular proliferation, increased apoptosis rate, and reduced the average xenografted tumor volume of the nude mice compared with control group. Up-regulation of CCAT1 lnRNA expression significantly increased the cellular proliferation and decreased apoptosis. The average xenograft tumor volume in this group had no obvious difference with the ones before the irradiation.ConclusionDown-regulating CCAT1 mRNA expression levels could inhibit the development of tumor and improve the tumor sensitivity to radiotherapy in nude mice transplanted with human cervical cancer cells XB1702, while up-regulating CCAT1 lnRNA expression levels could enhance the radiation resistance of tumor.
Uterine cervical neoplasms; Neoplasm transplantation; Mice, nude; XB1702 cells; Long non-coding RNA
GAO Jin-ping, Email: gaojinpinglf@163.com
10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.008
Chin Med Biotechnol, 2017, 12(1):40-44
065000 河北省廊坊市安次區(qū)醫(yī)院婦產(chǎn)科(高金蘋(píng));065000河北省廊坊市人民醫(yī)院化驗(yàn)室(張紹菊);065000 河北省廊坊市廣安醫(yī)院婦產(chǎn)科(羅志紅);065000 河北省廊坊市中醫(yī)院放射科(李津)
高金蘋(píng),Email:gaojinpinglf@163.com
2016-10-14
www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(1):40-44
Author Affiliations:Obstetrics and Gynecology, Anci District Hospital Gynecology (GAO Jin-ping), People's Hospital Laboratory (ZHANG Shao-ju), Gynecology of Guang'an City Hospital (LUO Zhi-hong), Radiology of Chinese Medicine Hospital (LI Jin), 065000 Langfang, China
www.cmbp.net.cn