生物素標記的甲基化間區位點擴增技術分辨不同組織DNA甲基化水平方法初探

王小怡，王博，王雪偉，高哲，郭大瑋

生物素標記的甲基化間區位點擴增技術分辨不同組織DNA甲基化水平方法初探

王小怡，王博，王雪偉，高哲，郭大瑋

DNA 甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一。在哺乳動物細胞中，DNA 甲基化參與基因表達和染色質結構的調控[1]，與多種癌癥的發生發展相關[2-3]。DNA 甲基化在胚胎發育早期、個體生長發育及多種疾病的發生發展過程中起著重要的作用，是當前表觀遺傳研究領域的熱點之一[4-5]。分析基因組中甲基化水平能夠了解不同組織之間、正常與疾病狀態以及不同年齡引起的甲基化水平的差異。Frigola 等[6]通過擴增甲基化間區位點（amplification of intermethylated sites，AMIS）分析了結腸癌組織與癌旁組織基因組中 CCCGGG位點的甲基化水平。該法通過 [α-33P]dATP 進行放射自顯影，對機體有很大的損害。有文獻報道可以用生物素標記的引物進行 PCR 擴增[7]，因此本研究嘗試用生物素標記引物進行 PCR 擴增代替放射性核素法分析基因組 DNA 甲基化水平（圖 1）。

圖 1 生物素標記引物進行 PCR 擴增分析基因組 DNA 甲基化水平原理示意圖（雙線代表基因組 DNA）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級 SD 大鼠 9 只，標記為 1 ～9 號，雄性，體重 180 ～ 200 g，購于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心（許可證編號：SCXK-(軍)2012-0004），飼養于山西醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內切酶 Rsa I 和 CviQ I、T4 連接酶均購自美國 NEB 公司；PCR 產物純化試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；rTaq 聚合酶購自日本 Takara 公司；化學發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TC-96/G/H(b)B 型基因梯度擴增儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 9 只大鼠隨機分為兩組，1 ～ 4 號正常飼養；5 ～ 9 號腦部局部雙側給予 2 nmol/L 的 δ-阿片受體激動劑 1 μl。一周后處死大鼠，取心、腦、肝、肺、腎、脾、胰組織，置于–80 ℃ 備用。

圖 2 5 號大鼠心、腦、肝組織以不同引物擴增時甲基化圖譜

1.2.2 大鼠組織基因組 DNA 提取 酚氯仿法提取大鼠組織的基因組 DNA（100 ng/μl），A260/280在 1.8 ～ 1.9。

1.2.3 甲基化間區位點擴增 10 U 的甲基化敏感性內切酶 Rsa I 消化 1 μg 基因組 DNA，37 ℃ 過夜酶切，留下鈍性末端（GT/AC）；酶切產物用 10 U 甲基化非敏感性內切酶 CviQ I 消化，25 ℃ 過夜酶切，留下粘性末端（G/TAC）。特異接頭準備：100 μmol/L MCA-V（5' TATCAG AGCTTTGCGAAT 3'）和 100 μmol/L Blue（5' ATTCGCAAA GCTCTGA 3'）等體積混合置于 95 ℃ 10 min，室溫約 2 h退火；1 nmol的接頭與 1 μg 雙酶切的產物在 T4 連接酶的作用下連接。PCR 產物純化試劑盒純化連接產物。

1.2.4 生物素標記的引物擴增兩端連接特異接頭的 DNA序列 用 5'-Bio-Blue-TAC 末端加 4 ～ 6 個隨機核苷酸的引物進行 PCR 擴增，引物序列為 5'-Bio-Blue-TAC-CTGT-3，5'-Bio-Blue-TAC-CTGTG-3'，5'-Bio-Blue-TAC-CTGTGC-3'。擴增體系：30 ng 連接產物，4 μmol/L 生物素標記的引物，1 U rTaq，2 μl dNTP，2.5 μl 10 × PCR buffer，滅菌水補足25 μl。擴增條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，68 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃ 10 min。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR 產物稀釋 5 倍，3 μl稀釋后產物與 12 μl 的變性上樣緩沖液 DLB（95% 甲酰胺、20 mol/L EDTA、0.09% 溴酚藍、0.09% 二甲苯青）混勻后 95 ℃ 變性 10 min，置于 –20 ℃ 備用。變性后樣品上樣 5 μl，8 mol/L 尿素、6% 的聚丙烯酰胺凝膠 200 V 恒壓電泳 2 h。使用半干轉印儀，以 0.5 × TBE 為轉膜液，將凝膠上的 DNA 轉移到尼龍膜上，電壓保持在 6 ～ 11 V 的條件下恒流轉膜 45 min。按化學發光 EMSA 試劑盒使用說明書進行顯色。

2 結果

2.1 引物的選擇以及同一只大鼠不同組織之間甲基化水平的比較

3' 末端隨機核苷酸數目的增加能夠減少擴增產物的條帶數目，使甲基化圖譜條帶清晰且容易分析。條帶灰度值越高說明甲基化水平越高。5 號大鼠的心、腦、肝組織分別以3' 末端增加 4、5、6 個核苷酸為引物擴增得到的甲基化圖譜，隨著末端核苷酸數的增加，條帶數目逐漸減少（圖 2）。選擇 3' 末端增加 4 個堿基（即 Bio-Blue-TAC-CTGT）為引物來分析大鼠組織的甲基圖譜，表明同一個引物同一只大鼠的不同組織的甲基化圖譜有明顯差異。

2.2 不同大鼠腦組織甲基化水平圖譜基本一致

1 ～ 4 號大鼠的腦組織甲基化圖譜基本一致。5 號大鼠經過局部腦阿片受體激動劑處理，其腦組織甲基化水平圖譜與 1 ～ 4 號大鼠腦組織有較大差異（圖 3）。

圖 3 不同大鼠組織甲基化圖譜

圖 4 DNA 片段長度范圍分析

2.3 甲基化位點之間 DNA 片段長度范圍分析

采用本實驗室現有的 H19 基因的引物，共用的上游引物 5' 端進行生物素標記，選擇 5 個不同的下游引物擴增后產物等比例混合制成標準品，電泳時和樣品一起上樣。由圖 4 可知電泳條帶在 200 ～ 1200 bp。

3 討論

用 AMIS 方法對基因組范圍內的甲基化水平進行檢測首先由 Frigola 等于 2002 年提出。實驗中作者采用SmaI/PspA1（CCCGGG）這對內切酶及接頭 DNA 巧妙地分離了甲基化與非甲基化狀態的胞嘧啶。由于在全基因組范圍內進行檢測，因此，與預設甲基化位置的基因芯片檢測方法相比，檢測范圍更加寬泛，例如：Illumina 推出的 Infinium Methylation EPIC BeadChip 一次可以檢測超過 850 000 個甲基化位點[8]，但這些甲基化位點傾向于與已注釋的基因表達調控相關，不免有檢測局限性；根據 Fazzari 和 Greally[9]對人類基因組計劃的資料分析表明，甲基化敏感酶 Hpa II的識別位點分布于人類已注釋的 CpG 島區域，約占總切點的 12%，其余大部分切點分布于其他未知的區域；Xu 等[10]在人類長片段重復序列檢出了可能作為分辨同卵雙生子DNA 甲基化位點，這些說明立足于整個基因組范圍內檢測DNA 甲基化的 AMIS 方法有其獨特的優點。

另一方面，由于 AMIS 檢測所涉及的片段較多，用普通顯色方法靈敏度不夠，因此，Frigola 等[6]采用了放射性檢測方法 。本文用生物素標記的引物檢測出了不同臟器的不同 DNA 甲基化水平。據 Frigola 的報道，同位素方法的檢測靈敏度為 1/16，我們在實驗過程中將樣品稀釋到 1/10仍能檢測到甲基化條帶。

與放射性同位素標記相比，生物素標記的引物 AMIS操作安全、簡單，適用于多個樣本，并能達到檢測出不同臟器的不同 DNA 甲基化水平的目的。該方法的靈敏度較高，少量的產物即可得到清晰的基因組 DNA 甲基化水平圖譜。因此，我們認為雖然非放射性 AMIS 的檢測靈敏度低于放射性標記，但 1 μg 的 DNA 模板用生物素標記的AMIS 法已然能夠檢出足夠條帶，從而滿足多數實驗的要求。如此可以避免放射性核素的使用。

本文通過非放射性 AMIS 替代放射性方法，得到了較為清晰的酶切位點基因組 DNA 甲基化水平圖譜。同一只大鼠的不同組織甲基化水平有明顯差異，而不同大鼠同一個組織的甲基化水平基本一致。唐韶青等[11]用 MSAP 技術對豬、牛、羊、小鼠、雞和鴨的基因組 DNA 甲基化水平檢測，發現同一動物的不同組織基因組 DNA 甲基化水平有差異。另有文獻報道，人的不同組織之間甲基化水平也是有差異的[12-13]，這與本研究結果一致。

本文中采用 Rsa I/CviQ I（GTAC）內切酶對進行檢測，觀察了基因組中非 CpG 二核苷酸處的甲基化修飾情況。與Frigola 等所用的 6 核苷酸內切酶相比，我們采用的識別4 核苷酸的內切酶理論上可能檢出更多的甲基化位置，采用3 端增加 4 ～ 6 個堿基的引物擴增，仍然能夠得到較多的條帶，更適用于兩個樣本間甲基化差異較少的檢材。此外，4 核苷酸內切酶分析甲基化水平得到的甲基化間區的 DNA 范圍 200 ～ 1200 bp，較 Frigola 等所用的 6 核苷酸內切酶得到的范圍窄，這是因為 4 核苷酸比 6 核苷酸出現的頻率高。

該方法的使用也存在一些局限性。圖 3 中 1 ～ 4 腦組織是鼠齡、體重情況一致的大鼠，其甲基化水平基本一致。若在腦局部給阿片受體激動劑（5 號大鼠），則其腦組織甲基化圖譜與 1 ～ 4 鼠腦組織有明顯不同，慢性使用阿片導致腦組織的 DNA 甲基化水平發生改變已有報道[14]，本實驗也觀察到經上述處理的鼠甲基化水平圖譜異于未處理鼠。可見藥物等會影響個體基因組甲基化格局的改變。此外，基因組水平 DNA 甲基化與年齡、疾病等亦有著密切的關系[15-17]。上述問題在使用該方法鑒別不同組織時應加以考慮。此外，由于該方法基于內切酶酶切，因此對 DNA 質量要求較高，對于 DNA 降解的樣本則無法進行檢測。脾臟 DNA 提取后瓊脂糖凝膠電泳發現 DNA 降解嚴重，這可能是導致圖 4 四個脾組織之間的甲基化格局不同的原因。因而，使用該方法應注意 DNA 提取質量，避免 DNA降解；同時，比較樣品間的 DNA 甲基化差異應保持實驗條件的齊同。

本次研究初步探索了用生物素標記的 AMIS 法替代放射性 AMIS 法進行大鼠腦組織甲基化水平檢測的可能性。后續我們期待用該方法探索其他組織的甲基化圖譜，找出各種組織之間基因組 DNA 的甲基化差異，以期用甲基化水平來區分不同組織。

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國家發改委、科技部印發高級別生物安全實驗室體系建設規劃（2016 – 2025年）

按照國務院《病原微生物實驗室生物安全管理條例》等有關要求，國家發展和改革委員會會同有關部委聯合編制了《高級別生物安全實驗室體系建設規劃（2016 – 2025 年）》。

詳情請登錄國家發展和改革委員會網站 http://www.ndrc.gov.cn/zcfb/zcfbtz/201612/t20161220_830455.html 查閱。

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.016

030001 太原，山西醫科大學法醫學院

郭大瑋，Email：guo8dawei@aliyun.com

2016-09-20