油茶籽油中角鯊烯的高效液相色譜分析

馬力??+陳永忠??+鐘海雁??+周波??+彭邵鋒??+李志鋼??+王湘南??+王保明??+彭映赫??+王瑞

摘要：建立了油茶籽油中角鯊烯的HPLC測定方法。樣品采用硅膠柱提純處理優于皂化處理、皂化處理后硅膠柱提純處理，得到的色譜峰雜峰少、角鯊烯峰型對稱、峰面積較大。最佳色譜條件為C18柱，流動相V乙腈 ∶[KG-3]V甲醇為 40 ∶[KG-3]60，檢測波長210 nm，流速為1 mL/min，柱溫為40 ℃。該方法下角鯊烯在0.01～0.4 mg/mL 范圍內濃度和面積呈現良好的線性關系，相關系數為0.999 6；平均回收率100.28%（RSD=1.9）；精密度RSD（n=6）為1.24%；可用于實驗室檢測油茶籽油中角鯊烯的含量。

關鍵詞：油茶籽油；角鯊烯；高效液相色譜；流動相；色譜條件

中圖分類號： O657.7文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0353-04

油茶籽油含角鯊烯、維生素E等活性成分，賦予其與眾不同的營養保健作用。角鯊烯是具有促進血液循環、細胞修復、抗氧化和消炎殺菌等功能的天然活性成分[1-3]，廣泛用于醫療保健品和化妝品等方面。目前角鯊烯軟來源主要是深海魚類，植物性來源的角鯊烯較少。已知莧屬植物種子油中角鯊烯含量可達5%～8%，甘草根、帶皮種子和去皮種子中角鯊烯含量分別為0.2%、0.104 5%、0.078 1%，橄欖油、棕櫚油、玉米油和米糠油等也含一定量的角鯊烯。角鯊烯的檢測尚未有相關國家標準或者規范性文件[4]，在現有的研究中大多采用薄層層析法（TCL）、氣相色譜法（GC）和液相色譜法（HPLC）[5]。但薄層層析法人工影響因素較多；氣相色譜法需要前期對檢測物進行衍生處理，易引入新的雜質，費時費力。本試驗采用TCL定性測定油茶籽油中是否含有角鯊烯，采用waters C18反相極性色譜柱考察流動相及流動相比例、流速及柱溫對油茶籽油中角鯊烯分離效果的影響。

1材料與方法

1.1試驗材料、儀器與試劑

1.1.1試驗材料供試的油茶籽由湖南省林業科學院提供。

1.1.2試劑甲醇、乙腈和正己烷，均為色譜純；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸銀、石油醚、氫氧化鉀、硫酸鈉和角鯊烯，均為分析純；柱層層析硅膠，為試劑級。

1.1.3試驗儀器榨油機，湖南省林業科學院自制；DHG-9070A型電熱恒溫箱，北京佳源興業科技有限公司生產；SZF-06GI粗脂肪測定儀，上海新嘉電子有限公司生產；KQ-700DV數控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司生產；P10-Y實驗室超純水器（國之源）；LC-2010AHT液相色譜儀，日本島津公司生產。

1.2試驗方法

1.2.1測定油樣的制取稱取1～1.5 kg油茶籽，置于干燥箱105 ℃干燥至恒質量后，用壓榨機提油，將油靜置、除雜后，備用。

1.2.2角鯊烯測定條件優化

1.2.2.1角鯊烯的定性分析用10 cm×20 cm硅膠 GF254薄層層析薄板鑒定油茶籽油中是否含有角鯊烯。

點樣：在距薄層層析板1側的底部1 cm處畫好1條直線作為起點線，用毛細管分別吸取標準角鯊烯溶液和油茶籽油樣品垂直輕輕地接觸到起點線上，樣點間距為1～1.5 cm。

顯色：將展開劑加入到層析缸中，將層析缸密封1 h，然后將薄層層析板放入進行展開，當展開劑的前沿已到達薄層層析板上端0.5～1 cm時，迅速取出薄層層析板，晾干。將除去展開劑的層析板，碘缸顯色20～30 min，即出現黃色斑點，取出后計算Rf值。Rf值為斑點中心距原點的距離與溶劑展開前沿距原點距離的比值。

1.2.2.2角鯊烯預處理優化

角鯊烯標準溶液的配制：稱取0.1 g的角鯊烯標準品于10 mL的容量瓶中，用正己烷定容至刻度并搖勻，配制成濃度為10 mg/mL的角鯊烯標準品溶液。

角鯊烯樣品預處理條件的優化分3種不同的處理方法。

處理1（A）：皂化處理。稱取1 g油茶籽油于250 mL的磨口錐形瓶中，加入2 mol/L的KOH-乙醇溶液50 mL，連接好回流裝置，在85 ℃的恒溫水浴鍋中回流1 h，移出后冷卻至室溫。將皂化液轉入250 mL的分液漏斗中，加入飽和氯化鈉溶液50 mL，然后加入50 mL石油醚，充分振搖萃取，靜置分層后將上層溶液轉入250 mL的分液漏斗中，下層溶液再用50 mL 石油醚萃取2次，合并3次的上層有機相溶液，用去離子水洗至中性，然后過無水硫酸鈉脫水，在35 ℃水浴中旋轉蒸發至近干，用正己烷定容至2 mL，混勻后，過0.45 μm微孔濾膜于進樣瓶中，作為待測液。

處理2（B）：硅膠柱提純處理。采用濕法裝柱法，將硅膠柱固定于鐵架臺上，倒入約100 mL的石油醚，稱取10 g經500 ℃烘干的硅膠，慢慢倒入硅膠柱中，靜置片刻，再加入 0.5 cm 無水硫酸鈉（約2 g），打開塞子，使石油醚緩慢淋洗下來，確保柱中硅膠填料均勻，不出現氣泡和斷層現象。稱取 1 g 左右的油茶籽油樣品放置于小燒杯中，用少量石油醚分數次潤洗小燒杯，洗滌液一并倒入小柱中，加入50 mL石油醚于硅膠柱中，打開旋塞，收集濾液，當石油醚液面與上端無水硫酸鈉層相切時，再分2次加入50 mL石油醚，收集全部的洗脫液至錐形瓶中，用旋轉蒸發儀濃縮濾液，然后用氮吹儀氮吹至干，隨后用正己烷定容至2 mL，充分振搖，過0.45 μm微孔濾膜，作為待測液轉移到進樣瓶中。

處理3（C）：皂化處理后硅膠柱提純處理。按處理1皂化萃取后，再按處理2硅膠柱提取。

1.2.2.3角鯊烯高效液相色譜測定的條件優化

流動相選擇：在流速為1 mL/min和柱溫40 ℃的相同條件下，改變流動相，考察甲醇、乙腈、甲醇/乙腈（V/V，50/50）體系對分離效果的影響。

流動相比例的選擇：在流速為1 mL/min和柱溫40 ℃的相同條件下，選擇較優的流動相比例，考察流動相比例對分離效果的影響。

柱溫的選擇：在乙腈/甲醇（V/V，40/60）作為流動相和流速為1 mL/min的相同條件下，改變柱溫（35、40、45 ℃），考察柱溫對分離效果的影響。

流速的選擇：在流速為1 mL/min和柱溫40 ℃的相同條件下，改變流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），考察流速對分離效果的影響。

2結果與分析

2.1薄層層析法（TLC）定性檢測油茶籽油中的角鯊烯

由圖1可知，在Rf=0.662處有一個黃色斑點，斑點非常清晰，未產生拖尾，與角鯊烯標準品完全一致。說明油茶籽油中含有角鯊烯。

2.2預處理條件的測定結果

采用3種不同的預處理方法對油茶籽油樣品進行處理，處理后的色譜圖如圖2至圖4所示。

由圖2至圖4可知，油茶籽油經不同的預處理方法得到的角鯊烯HPLC圖譜差異很大。經皂化處理后的HPLC圖譜雜[CM（25]質峰較多，目標峰（角鯊烯）附近有干擾，損害色譜柱，且皂[CM）]

化時間過長。經硅膠柱提純處理后的HPLC圖譜峰形較好，附近沒有雜質峰的干擾，方法簡單且角鯊烯峰型對稱、峰面積較大。經皂化處理和硅膠柱提純處理后的HPLC圖譜與硅膠柱提取后的HPLC圖譜處理的效果差別不大，但角鯊烯峰面積偏低，且操作過程較為繁瑣，因此硅膠柱提取法是一種較優的預處理方法，最終能使角鯊烯得到良好的分離效果。

2.3角鯊烯檢測高效液相色譜法條件的研究

2.3.1流動相的選擇

由圖5可知，采用乙腈作為流動相，由于乙腈具有較強的洗脫能力，圖譜中僅有1個大峰，溶劑峰與目標峰沒有分開。采用甲醇和甲醇/乙腈（V/V，50/50）分離效果均較好，因乙腈較甲醇使柱內承受的壓力低，考慮到色譜柱的使用壽命，選用甲醇/乙腈作為流動相。

2.3.2流動相比例的選擇由圖6可知，樣品在不同比例的流動相條件下都能與雜質峰分開，但是隨著乙腈比例的增加，樣品的保留時間增加，當乙腈增加到60%時，樣品主峰的保留時間為29 min。一般情況下，因乙腈的洗脫能力較甲醇強，增加乙腈的比例，樣品的保留時間縮短，但在本試驗中，隨著乙腈的比例增加，樣品的保留時間反而延長，這可能與角鯊烯的特有性質有關。為縮短樣品的保留時間，選擇乙腈/甲醇（V/V，40/60）作為流動相。

2.3.3柱溫的選擇

柱溫是最重要的色譜操作條件，它直接影響色譜柱的選擇性、色譜峰區域展寬和分析速度[6]。由圖7可知，在柱溫為35、40、45 ℃時，峰形有一定的變化，但在試驗中觀察到峰面積變化很小；樣品主峰跟其他雜質峰均分離良好，樣品的保留時間隨著柱溫的升高都前移了。因柱溫太高容易損傷色譜柱，綜合考慮樣品的保留時間和柱子的使用壽命，柱溫選擇40 ℃。

2.3.4流速的選擇

由圖8可知，在流速選擇0.8、1.0、1.2 mL/min 時，樣品主峰跟其他雜質峰均分離良好，流速增大時，峰寬變小，但峰面積變化不大。樣品的保留時間隨著流速的增大而縮短。同時，隨著流速的增大，柱壓會上升。綜合

考慮分析時間及柱子使用壽命，流速選擇1.0 mL/min。

2.4高效液相色譜法檢測角鯊烯的效果評價

2.4.1標準角鯊烯濃度與峰面積的線性關系

量取一定量10 mg/mL的標準溶液，用正己烷稀釋，配制成濃度分別為001、0.05、0.10、0.15、0.20、0.40 mg/mL的標樣，按選定的色譜條件，取10 μL進樣，記錄色譜圖，測定其峰面積，以峰面積（y）對質量濃度（x）進行線性回歸，建立標準曲線圖（圖9）及線性回歸方程。

線性回歸方程y=4×107x+198 720，r2=0999 6，線性范圍0.01～0.4 mg/mL。

2.4.2穩定性試驗

精確稱取油茶籽油樣品1 g，經硅膠柱提取處理后用正己烷定容至2 mL，每隔8 h進樣10 μL，按照優化的色譜條件進行定量分析。穩定性試驗結果見表1。根據表1，計算出RSD為1.26%，說明用本試驗方法制成的供試樣品溶液中的角鯊烯在24 h內穩定。

2.4.3回收率試驗

加標回收率是表示準確度的一個指標。稱取已知角鯊烯含量（80.02 μg/g）的油茶籽油樣品，再添加5 μL 角鯊烯標準品溶液。經硅膠柱提取處理后用正己烷定容至2 mL，進樣10 μL，按照優化的色譜條件進行定量分析，重復3次，回收率試驗結果見表2。

根據表2，得到該試驗方法的平均回收率為100.28%，RSD為1.9%，說明該方法的回收率良好，即測定方法有良好的準確度，是可靠的。

2.4.4精密度的測定

柱溫為40 ℃。該方法下角鯊烯在0.01～0.40 mg/mL范圍內濃度和面積呈現良好的線性關系，相關系數為0.999 6，平均回收率100.28%（RSD=19%），精密度RSD（n=6）為124%。該方法可用于實驗室檢測油茶籽油中角鯊烯的含量。

液相色譜法[7-8]已應用于甘草[9-10]、羅漢果[11]中角鯊烯含量的測定，但應用于油茶籽油的檢測中尚未有報道。本研究建立了油茶籽油中角鯊烯的HPLC測定方法，對建立油茶籽油中角鯊烯含量測定的標準方法具有參考價值。

參考文獻：

[1]鐘冬蓮，湯富彬，沈丹玉，等. 油茶籽油中角鯊烯含量的氣相色譜法測定[J]. 分析試驗室，2011，30（1）：104-106.

[2]王海洪，黃曉春. 用深海鯊魚制備角鯊烯、角鯊烷[J]. 東海海洋，1999，17（2）：43-46.

[3]陳思偉，陳上云. 角鯊烯對部分T淋巴細胞亞群的影響[J]. 廣東藥學院學報，1997，13（2）：131-132.

[4]陳偉珠，方華，張怡評，等. 超高效液相色譜法檢測角鯊烯[J]. 食品與發酵科技，2014，50（6）：74-76，86.

[5]梁新華，鄭彩霞，張風俠，等. 甘草角鯊烯的提取及高效液相色譜分析[J]. 北京林業大學學報，2010，32（2）：123-126.

[6]趙軼男. 高效液相色譜技術（HPLC）影響因素的選擇[J]. 分析實驗室，2007，26：340-341.

[7]李青，譚紅，袁鑫，等. 高效液相色譜法測定核桃青皮中胡桃醌的含量[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：259-261.

[8]李智寧，李湄川，胡德禹，等. 高效液相色譜法測定煙草上的噻森銅[J]. 江蘇農業科學，2015，43（1）：284-286.

[9]汪運明，陳華勇，楊繼國，等. 氣相色譜質譜聯用測定茶油中角鯊烯含量[J]. 食品工業科技，2011（6）：404-406.[ZK）]

[10]梁新華，鄭彩霞，張風俠，等. 甘草角鯊烯的提取及高效液相色譜分析[J]. 東北林業大學學報，2010，32（2）：123-126.

[11]陳全斌，程忠泉，楊建香，等. 羅漢果種仁油中角鯊烯的高效液相色譜分析[J]. 廣西科學，2006，13（2）：118-120.