親水作用色譜在糖類化合物分析中的應用

蒲江華，趙 峽，韓文偉，白明月

(中國海洋大學 海洋藥物教育部重點實驗室，山東省糖科學與糖工程重點實驗室，醫藥學院，山東 青島 266003)

親水作用色譜在糖類化合物分析中的應用

蒲江華，趙 峽*，韓文偉，白明月

(中國海洋大學 海洋藥物教育部重點實驗室，山東省糖科學與糖工程重點實驗室，醫藥學院，山東 青島 266003)

糖類化合物的結構和組成分析對于探究糖的結構與功能的關系具有重要作用。親水作用色譜(HILIC)對糖類等極性化合物具有良好的分離效果。該文介紹了適合糖類分析的常用HILIC柱固定相及其分離機制，論述了強洗脫溶劑比例、流動相pH值、緩沖鹽濃度和色譜柱溫度對HILIC分離效果的影響，并舉例說明了HILIC法在單糖組成、糖胺聚糖二糖組成、寡糖聚合度、糖苷、糖脂、糖醇以及N-/O-糖鏈分析中的應用。

親水作用色譜；固定相；保留機制；糖類分析；綜述

糖及其復合物的分析檢測在醫學、藥學、生物學等領域均具有重要作用。由于糖類化合物的極性較大，在反相色譜(RPLC)上保留太弱甚至不保留，常需經過衍生化帶上疏水基團后才能進行分析；而在正相色譜(NPLC)上又保留過強，難以被非極性的流動相洗脫下來。親水作用色譜(Hydrophilic interaction chromatography，HILIC)因以強極性材料作為固定相，以高比例的有機溶劑-水體系作流動相[1]，近年來廣泛用于糖類、蛋白質、多肽、氨基酸、生物堿、皂苷等成分的分離和分析[2-4]。本文論述了適合糖類分析的常用HILIC柱固定相及其分離機制，探討了強洗脫溶劑比例、流動相pH值、緩沖鹽濃度、柱溫等色譜條件對糖類化合物分離效果的影響，并列舉了HILIC在不同糖類化合物分析中的應用。

1 常用固定相

HILIC色譜柱的固定相種類繁多，包括未衍生化的純硅膠柱及一些極性官能團(如氨基、酰胺基、二醇基、氰基、糖基等)修飾的硅膠或者聚合物[5]，以適應不同的分離目的。以聚合物為基質的固定相能適用于強酸或強堿環境，但其分離效率遠不如以硅膠為基質的固定相，因此應用較少[6]。在糖類化合物分析中常用的以硅膠為基質的固定相主要有氨基柱、酰胺基柱、兩性離子柱、糖基柱等(圖1)。氨基柱(如TSKgel NH2-100)是最早用于糖類化合物分析的HILIC柱，對糖的分離具有很好的選擇性，但其受緩沖鹽濃度和pH值影響較大，易與酸性化合物發生死吸附，且氨基易與還原糖的醛基形成席夫堿從而影響鍵合相的性質，因此在糖的分析中受到了限制[5,7-9]。酰胺基柱(如XAmide)穩定性好，不易發生死吸附，且選擇性佳，在糖類化合物的分析中應用最為廣泛[10]。兩性離子柱(如ZIC-HILIC)的固定相表面同時含有正負電荷官能團，因此親水性好，受pH值和離子作用的影響較小，對中性、堿性、酸性寡糖均具有很好的分離選擇性[7,11]。糖基柱是在硅膠表面鍵合上糖基，如麥芽糖(Click maltose)、環糊精(Clickβ-CD)等，因此具有很強的極性和氫鍵作用，可廣泛應用于單糖、寡糖、多糖和糖肽等分析[7,12]。

圖1 在糖類化合物HILIC分析中常用的固定相結構Fig.1 Structure of stationary phase of HILIC column commonly used in carbohydrate analysis

2 保留機制

圖2 親水分配作用、氫鍵作用及靜電作用機制示意圖Fig.2 Mechanisms of hydrophilic partitioning,hydrogen bonding and electrostatic interaction

HILIC柱的保留機制較為復雜，主要有分配機制和吸附機制(包括氫鍵作用、偶極-偶極作用等)，還涉及靜電作用和離子交換作用等[6,9,13-14]。分配機制是指分析物在親水固定相吸附的水層與流動相之間發生液/液分配作用，是廣為接受的HILIC保留機制[8]；氫鍵作用和靜電作用常常發生在分析物與固定相材料之間，受流動相組成的影響較大，其作用模式如圖2所示。糖是多羥基化合物，其在HILIC柱上的保留除分配作用外，還有較強的氫鍵作用，而且帶電荷的酸性糖和堿性糖還會與固定相發生靜電作用[9,15]。HILIC的保留機制主要取決于固定相特性、流動相組成以及分析物性質，隨著分析條件改變，其保留機制也會相應改變[16-17]。

3 分離條件的影響

HILIC的分離效果受多種色譜條件的影響，其中強洗脫溶劑比例、流動相pH值、緩沖鹽濃度及色譜柱溫度對糖類化合物在HILIC柱上的保留均具有重要影響[11]。

3.1 強洗脫溶劑的影響

圖3 水的比例對Click XIon柱分析低聚木糖聚合度的影響Fig.3 Influence of water proportion on degree of polymerization analysis of xylo-oligosaccharides by Click XIon column

HILIC的流動相一般是由水相-有機相組成的混合溶劑體系，水或者水的鹽溶液為強洗脫溶劑，有機相為弱洗脫溶劑。理想的有機相應易與水混溶，且不能是質子供體或受體，所以一般多采用乙腈[18-19]。在HILIC模式中，化合物按照極性由小到大的順序出峰，在乙腈和水組成的流動相中，強洗脫溶劑的增加會加快糖的出峰時間[9,20]。如本實驗室考察了流動相對Click XIon柱分離低聚木糖聚合度的影響(圖3)，發現隨著水相比例的增加，低聚木糖的洗脫速度加快，分析效率提高，但同時分離度也有所降低。

3.2 流動相pH值的影響

流動相的pH值能影響極性分析物和固定相的電荷狀態，從而影響分析物在HILIC柱上的保留強弱。若二者所帶電荷相同則相斥，分析物在固定相上的保留會減弱；如帶相反電荷則相吸，分析物的保留增強。pH值的影響與分析物性質和固定相種類相關，pH值對同一色譜柱不同性質的分析物以及同一分析物不同固定相的色譜柱均會有不同的影響[10,21-22]。Yan等[23]采用BEH Amide柱分離中性單糖時發現隨著pH值的增加，糖的洗脫加快，保留時間縮短。這是因為pH值越高，糖脫質子化程度越高，與硅醇基發生靜電相斥作用，所以中性單糖在色譜柱上的保留減弱。

Fu等[24]總結了流動相pH值對不同類型HILIC柱的影響，發現當pH值從6.8變化到3.0時，Clickβ-CD，Click Maltose，XAmide和Click TE-Cys這4種色譜柱的固定相表面會從負電荷轉變為正電荷。所以，酸性糖應在pH≥6.8的條件下分離以減小離子作用；堿性糖應在pH≤3.0的條件下分離來減小靜電吸引作用，避免峰拖尾。硅膠柱和二醇基柱在pH 6.8時表面帶負電，而在pH 3.0時接近電中性，因此在pH 3.0的條件下既適宜分離堿性糖，又可用于分離酸性糖。TSK Amide-80柱在pH 3.0～6.8范圍內帶負電，在pH<7.0時適合分離酸性糖，在pH>7.0時適合分離堿性糖。

3.3 緩沖鹽濃度的影響

3.4 色譜柱溫度的影響

溫度能影響流動相粘度、溶質擴散系數以及溶質在固定相和流動相之間的遷移焓變，對HILIC的分離效果有重要影響[10,17]。一般而言，柱溫的升高能增大溶質的擴散系數，縮減保留時間，增加檢測靈敏度[17]。如采用TSK Amide-80柱分離單糖時，隨著柱溫從40 ℃增加至60 ℃，各單糖的洗脫加快，糖的峰形變得更加尖銳[25]。但當以靜電吸引為主導的保留機制時，溫度的升高反而會導致保留的增強[12,18]。柱溫除對HILIC柱的保留時間和靈敏度有影響以外，還能影響糖的峰形。如圖4所示[24]，當柱溫為30 ℃時，Click Maltose，XAmide，Silica，TSK Amide-80等HILIC柱會產生葡萄糖峰的α和β異構體裂分，且隨著柱溫上升，裂分程度逐漸降低甚至消失，具有這一特性的HILIC柱可以用于糖的異構體分析。Moni等[26]自制的糖基HILIC柱可在合適的低溫條件下分離吡喃糖和呋喃糖的異構體。對于氨基柱、二醇基柱等，因它們自身的固定相材料能加快端基差向異構體的轉換，可避免雙峰的出現[7]。

4 實例分析

4.1 單糖組成及寡糖分析

單糖組成分析有利于多糖的結構解析，常采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜法[27]，該方法能同時分析11種常見的中性、酸性和堿性單糖，但衍生過程費時費力。而采用HILIC法分析單糖組成可不需衍生，前處理簡單，分析時間短，如BEH amide柱可在30 min內完全分離8種植物來源的中性單糖[23]。HILIC法還能同時快速分析多種中性單糖、二糖和三糖，如Ikegami等[28]采用200T-PAAm硅膠柱，可在5 min內完成核糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、棉籽糖及景天庚酮糖的同時分離。但HILIC法方法的不足是尚不能同時完全分離多種中性、酸性和堿性單糖。

4.2 糖胺聚糖二糖組成分析

糖胺聚糖是一類酸性多糖，由糖醛酸和氨基糖組成的二糖片段重復連接而成。二糖組成中糖醛酸和氨基糖種類的不同以及硫酸化位點和個數的不同，使得糖胺聚糖結構多樣化，從而具有不同的生理功效[29]。二糖組成一般采用強陰離子交換色譜法進行分析[30]，但該方法因使用高濃度的緩沖鹽，難以與質譜聯用進行在線檢測。HILIC采用乙腈-水(或低濃度的揮發性緩沖鹽)體系，可實現與質譜的在線聯用，提高檢測的靈敏度[12,31]。如采用ZIC-HILIC柱可同時分離2-氨基苯甲酰胺(2-AB)標記的不同位點取代及不同取代度的硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素[32]。

4.3 寡糖聚合度分析

寡糖的生物功能與其聚合度(dp)也有密切關系[33]，因此其聚合度分析方法的建立有助于產品的質量控制。寡糖聚合度分析常采用高效凝膠過濾色譜法，但對dp相近的同一系列寡糖分子量差異小，難以通過該方法達到基線分離，而HILIC法對不同dp的寡糖具有良好的分離效果。Fu等[34]采用麥芽糖基柱成功分離了dp10～50的果寡糖及dp5～25的殼寡糖。吳成玲等[35]研究發現酰胺基柱可以有效分離dp2～20的透明質酸寡糖；在較高溫度下，兩性離子柱可有效分離dp2～12的硫酸軟骨素寡糖；而二醇基柱還可分離dp4～20的肝素寡糖。

圖5 USP-HILIC柱分離多元醇類化合物[38]Fig.5 Analysis of a polyols mixture by USP-HILIC column[38]elution order:1,3,5-cis,cis-cyclohexanetriol,xylitol,mannitol,chiro-inositol and myo-inositol(洗脫順序：1,3,5-環己烷三醇、木糖醇、甘露糖醇、D-手性肌醇、肌醇)

4.4 糖苷、糖脂及糖醇分析

HILIC在糖苷、糖脂和糖醇的分析檢測方面也有重要應用。如金高娃等[36]采用Click XIon柱對皂苷、黃酮苷等14種糖苷類化合物實現了有效分離；Melo等[37]采用HILIC-ESI-MS法分離紅藻Chondruscrispus中的糖脂并表征了其結構；Kotoni等[38]采用HILIC方法實現了1,3,5-環己烷三醇、木糖醇、甘露糖醇、肌醇及D-手性肌醇等多元醇的有效分離(圖5)。

4.5 N-/O-糖鏈分析

糖鏈是細胞表面的重要生物信息分子，許多疾病與糖鏈結構的改變密切相關[39]。而糖鏈的結構解析一直是糖生物學的重難點，糖鏈的分離是糖鏈結構研究中至關重要的環節，對其結構解析的準確性有重要影響。HILIC可與質譜在線聯用，用于N-/O-糖鏈的結構分析[40-41]。如可采用BEH amide柱分析倉鼠卵巢來源的融合蛋白及免疫球蛋白G4釋放的N-糖鏈(圖6)[42]；采用兩性離子柱可分離唾液酸化的N-糖鏈的異構體[43]；采用TSKgel Amide-80可分析內源性鼠胃粘蛋白釋放的O-糖鏈[44]等。

圖6 BEH amide柱分析2-AB標記的融合蛋白(A)和免疫球蛋白G4(B)釋放的N-糖鏈[42]Fig.6 2-AB-labeled N-glycans released from a CHO-derived fusion protein(A) and an NS0-derived IgG4(B) by BEH amide column[42]

5 結論與展望

HILIC對極性化合物和離子型化合物具有特殊的分離效果，彌補了RPLC和傳統的NPLC在分析上的不足，為糖類化合物的分析開拓了新的局面。研究HILIC的保留機制及色譜條件(如流動相組成、pH值、緩沖鹽濃度及柱溫)對保留的影響，有助于實現糖類化合物更快和更好的分離效果。隨著HILIC柱固定相材料的不斷發展，可適應不同化合物的分離需求，在此，也期待能同時分離酸性、堿性和中性糖的色譜柱早日問世。此外，HILIC與質譜技術的聯用也成為寡糖結構分析的重要手段，將可以進一步解決糖類分析中的更多難題。

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Application of Hydrophilic Interaction Chromatography in Analysis of Carbohydrates

PU Jiang-hua,ZHAO Xia*,HAN Wen-wei,BAI Ming-yue

(Key Laboratory of Glycoscience and Glycotechnology of Shandong Province,Key Laboratory of Marine Drugs of Education Ministry,School of Medicine and Pharmacy,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The analysis of carbohydrate structure and composition plays a vital role in the study of structure-activity relationship of carbohydrates.Hydrophilic interaction chromatography(HILIC) could be used to separate polar compounds like carbohydrates with satisfactory resolution.The stationary phase and retention mechanism of HILIC column commonly used in carbohydrates analysis were introduced.The effects of strong elution solvent ratio,mobile phase pH value,buffer salt concentration and column temperature on separation were also discussed.Application examples in analysis of monosaccharide composition,disaccharide composition of glycosaminoglycans,polymerization degree of oligosaccharides,glycosides,glycolipids,sugar alcohols and N-/O-glycans by HILIC were illustrated in this paper.

hydrophilic interaction chromatography;stationary phase;retention mechanism;carbohydrate analysis；review

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.025

2016-07-17；

2016-09-20

國家自然科學基金-山東省政府聯合資助項目(U1406402)；國家“十二五”科技支撐計劃(2013BAB01B02)

*通訊作者：趙 峽，博士，教授，研究方向：海洋糖類藥物，Tel：0532-82031560，E-mail：zhaoxia@ouc.edu.cn

O657.7；O629.1

A

1004-4957(2017)01-0145-06