組合肽配體庫技術富集蛋白研究進展

樊嬌嬌，李蘇穎，李春紅，陳 華，夏之寧，楊豐慶*

(1.重慶大學 化學化工學院，重慶 400031；2.河南醫學高等專科學校 藥學系，河南 鄭州 451191)

綜 述

組合肽配體庫技術富集蛋白研究進展

樊嬌嬌1，李蘇穎2，李春紅1，陳 華1，夏之寧1，楊豐慶1*

(1.重慶大學 化學化工學院，重慶 400031；2.河南醫學高等專科學校 藥學系，河南 鄭州 451191)

低豐度蛋白是生物體中重要的活性物質，參與新陳代謝、轉錄和翻譯等多種生理及病理過程，因此對低豐度蛋白的研究具有重要意義。組合肽配體庫技術(CPLL)是富集低豐度蛋白的一種有效方法，通過CPLL富集作用可以實現低豐度蛋白的檢測與鑒定。該文總結了CPLL應用于不同領域中(包括人體、動物源、植物源等蛋白研究方面)低豐度蛋白樣品的富集研究，可為CPLL的進一步應用提供參考。

低豐度蛋白；組合肽配體庫技術；蛋白質組學；研究進展;綜述

蛋白質組(Proteome)一詞最早由Wilkins等于1994年提出，是指一個細胞或組織中由基因組所表達的全部蛋白質[1]。根據每種蛋白在蛋白質組中的含量差異，通常可將蛋白質組中的蛋白質分為兩類，即低豐度蛋白(Low-abundance proteins,LAP)和高豐度蛋白(High-abundance proteins,HAP)。其中，蛋白豐度的高低可用密碼子傾向指數(Codon Bia Index,CBI)表征，CBI代表了特定密碼子表達相同氨基酸殘基的傾向，CBI<0.2即歸為LAP。不同生物體中，LAP和HAP的含量差異巨大，尤其是在復雜的生物體中，二者的含量差異可達108以上[2]。LAP作為生物體的重要蛋白成分，雖然含量很低，對生物體的生物活性卻有重大影響。不同動植物生物體中的蛋白質種類和含量各有差異，在進行蛋白質分析時，HAP會在不同程度上影響LAP的分析和檢測。同時，由于蛋白質不具有DNA能在體外被大量擴增的性質[3]，所以如何富集和分離LAP是目前蛋白質組學研究的熱點之一。

除了傳統的蛋白富集方法如親和色譜分離法、液相等電聚焦分離法、聚乙二醇分級沉淀法之外，近幾年研究報道了一種有效的LAP富集方法——組合肽配體庫技術(Combinatorial peptide ligand library,CPLL)，即具有捕獲LAP能力的由數百萬六勝肽(又稱六元勝肽，Areginine essence)組成的配體庫[4]。本文對LAP的富集分離方法進行了簡要介紹，重點綜述了CPLL富集LAP的方法在不同領域(人體、動物及植物源蛋白)研究中的應用，以期為CPLL的進一步研究和應用以及不同生物體中LAP的富集純化研究提供參考。

1 低豐度蛋白的富集分離方法

LAP的富集技術主要包括親和色譜分離法[5-6]、亞細胞器分離法[7-8]、液相等電聚焦分離法[9-10]以及聚乙二醇分級沉淀法[11]等。此外，也可通過去除HAP使LAP的濃度相對增大，以達到富集并檢測LAP的目的，如超濾離心法、金磁微粒法等[12-14]。

親和色譜分離法[5-6]是利用親和吸附作用分離純化生物物質的方法，其固定相是鍵合親和配基的親和吸附介質。由于目標產物是基于生物親和作用(抗原與抗體、激素與受體、酶與基質等)吸附在固定相上而分離，因此親和色譜具有高度選擇性。馬梅蘭等[15]依據親和層析法制備的柱式白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒結合超濾離心法去除血清中的HAP(白蛋白、免疫球蛋白)，達到了檢測血清中能夠反映疾病病理、生理等相關信息的LAP的目的。在采用這種分離方法純化LAP時，不同的分離對象需要配備專一的配基并選擇特定的色譜柱，因而親和色譜分離技術在分離蛋白質樣品中的應用受到限制。利用亞細胞器分離法[7-8]進行蛋白樣品分離是通過細胞器的純化和亞細胞組分的分離，來降低樣品的復雜性，從而增大相應蛋白質組分的濃度。孔漢金等[16]總結了近年來不同亞細胞器的蛋白質組學研究進展。高純度亞細胞器的獲得成本高、難度大等是限制該方法應用的關鍵因素之一。液相等電聚焦分離法[9-10]的原理與固相等電聚焦一致，是根據蛋白的等電點不同來分離蛋白。Fountoulakis等[17]利用該方法從大鼠腦蛋白中富集了鈣結合蛋白、類視錐蛋白等大量LAP。液相等電聚焦分離需在無鹽溶液中進行，而在無鹽溶液中蛋白質可能發生沉淀，同時該技術還要求樣品中的蛋白成分必須在其等電點范圍內，因此該法不適用于在其等電點范圍內不溶或易發生變性的蛋白富集。此外，聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)[11]是一種直鏈的高分子聚合物，能夠破壞蛋白質分子表面的水化層從而使蛋白質沉淀，已被廣泛應用于蛋白的分級提取。在分級提取時，通過改變PEG濃度梯度可將HAP(如二磷酸核酮糖羧化酶，Rubisco)富集在單一PEG濃度組分中，從而提高后續雙向電泳分析中對LAP的檢測靈敏度。目前，該法已被用于天女木蘭種子[18]、水稻葉鞘[19]、擬南芥[20]、卷柏[21]、十大功勞[22]及生菜種子[23]等植物中LAP的富集。但樣品中殘留的PEG可能會使凝膠背景變暗是PEG法的一大缺點，這會直接影響雙向電泳的分辨率，還可能會抑制離子信號從而干擾后續蛋白質的質譜分析。

圖1 組合肽配體庫技術的原理圖[27]Fig.1 Principle of combinatorial peptide ligand library[27]

Furka等[24]和Lam等[25]在1991年提出“一珠一肽”，隨后Turk等[26]于2003年提出配體庫的概念，而Thulasiraman等[27]于2005年在二者的基礎上開發了CPLL技術，并將其應用于實際的血清和尿液等生物樣品中LAP的富集。CPLL是一種新型的LAP富集方法，與上述的蛋白樣品處理方法相比，它能減小樣品中蛋白濃度的動態變化范圍。有諸多研究者對CPLL的原理進行了介紹[28-32]，其核心是六肽組合配體庫的建立，即在多孔的固相層析介質上合成和連接由不同氨基酸殘基組成的數百萬的短肽配體(常用的是六肽配體)，這些短肽配體構成一套組合的短肽配體庫，即組合肽配體庫。蛋白質可與鍵合在聚丙烯酸酯磁珠上的六肽配體發生親和反應，因配體庫中每種配體的量相同，因此HAP的相應配體會迅速飽和，而LAP逐漸被富集并趨于飽和。洗去未結合的HAP，最后將親和結合的所有蛋白質洗脫下來供后續分析，由此達到降低樣品中蛋白濃度的動態范圍和富集LAP的目的(如圖1)。

肽庫的制備主要有兩種方法[33]：①生物肽庫系統(隨機肽庫)，如絲狀噬菌體肽庫和質粒肽庫；②組合技術：“反復選擇合成法”；“選擇法”，即“一珠一肽”合成法；反復比較合成法。在制備CPLL肽庫時，以“一珠一肽”合成法為主，以三肽的合成為例(圖2)：A代表丙氨酸，G代表甘氨酸，V代表纈氨酸，將聚甲基丙乙酸酯樹脂球載體均分后，分別放入盛有A、G和V的3個反應器中，待縮合反應完成后，將3個反應器中的載體取出，混合均勻，重新平均分裝到3個反應器中進行下一輪縮合反應。待3次縮合反應(分離、結合和再結合)完成后，合成得到27種可能序列的三肽。同樣，采用此方法(采用20種氨基酸為原料)可在數天內合成一個高達2×106的六肽庫[28,33]。Thulasiraman等[27]提出合成的配體庫必須滿足3個條件：①必須保證有足夠的、可重復性的、多樣性的配體，以結合所給復雜樣品中的每一個蛋白；②配體與蛋白之間的解離常數必須與蛋白濃度相兼容；③配體及其組成成分必須與未知的待測樣品兼容，同時配體必須具有足夠高的結合能力來捕獲足夠多的蛋白以便于后續的檢測分析。但由于合成過程中會存在某種蛋白與配體不兼容的情形，且不能保證每個配體珠與對應的氨基酸均能反應完全，所以自組裝合成的配體庫不一定適合富集待測樣品中的所有LAP。目前市售的美國BioRad公司生產的CPLL配體庫(ProteoMiner)是應用最廣泛的六肽配體庫，其為采用16種不同氨基酸組合而成含1 670萬種的配體庫[34]。目前，該技術已被廣泛應用于人體、動物源和植物源等蛋白樣品中LAP的分析研究。

圖2 配體庫合成步驟示意圖[25]Fig.2 Scheme of combinatorial peptide library synthesis[25]

2 組合肽配體庫技術的應用研究進展

2.1 在人體蛋白組研究中的應用

LAP對維持人體正常的生理功能具有獨特作用，因而對LAP的研究可以促進對人體局部生理功能的了解。張淵[35]采用CPLL結合LC-MS/MS技術分析了非小細胞肺癌患者尿液中的潛在生物標志物。結果表明經CPLL處理后，尿液外泌體(Exosomes，活細胞分泌的來源于晚期核內體的膜性囊泡)中含有的HAP量明顯減少，并檢測出512個LAP(55.36%為可溶性蛋白，44.93%為膜蛋白)，其中374個在之前的尿蛋白質組研究中未見報道，這些LAP可為非小細胞肺癌患者的治療提供參考。Bruschi等[36]研究了小兒內科患者腹膜透析液的蛋白質組學特征。通過MS鑒定，結果顯示經CPLL富集后的樣品中有5個HAP(白蛋白、血清鐵傳遞蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-微球蛋白和免疫球蛋白)含量明顯減少，同時檢測出約700個LAP，這些LAP可為該病的進一步研究提供參考。Selvaraju等[37]采用CPLL、凝集素親和層析法(Lectin affinity chromatography,LAC)和MS技術對乳腺癌患者體內的血清蛋白進行了富集與鑒定，結果共鑒定出乳腺癌患者血清中58個與健康人血清蛋白不同的差異蛋白，其中有17個屬于LAP。這些LAP可為乳腺癌的進一步研究及治療提供依據，同時該研究也為CPLL與其他技術的結合使用提供了參考。

在樣品預處理過程中多種因素可能會影響CPLL富集LAP的效果，因此優化樣品預處理條件可進一步提高CPLL富集LAP的效果。為了比較CPLL在離子間相互作用和疏水作用兩種條件下對蛋白捕獲的影響，Santucci等[38]在生理pH 7.2條件下采用能增加離子間相互作用的低濃度鹽(25 mmol/L NaCl)和能促進疏水作用的高濃度鹽(1 mol/L (NH4)2SO4)分別處理人血清蛋白樣品，之后進行CPLL富集、雙向電泳分離及MS分析。結果發現，在人血清蛋白樣品鑒定出的305個蛋白中，52%的蛋白在兩種預處理條件下共同含有，20%的蛋白在離子間相互作用條件下特有，28%的蛋白在疏水作用條件下特有，即表明該兩種條件均能在一定程度上促進CPLL對LAP的富集。此外，有研究[39-40]報道CPLL富集過程中會出現“蛋白損失”的現象，而此研究結果顯示離子間相互作用條件下的“蛋白損失”為5%，疏水作用條件下無“蛋白損失”，表明這兩種條件均能減小CPLL富集過程中的“蛋白損失”。Thulasiraman等[27]采用CPLL、雙向電泳和MS技術分析和鑒定人體血清中的LAP。結果表明相比于未處理樣品(檢測出195個蛋白)，經CPLL富集后的樣品中檢測出487個蛋白，諸如玻璃體結合蛋白、C3a過敏毒素、C4a過敏毒素、血清淀粉樣蛋白A、載脂蛋白J、C4結合蛋白、血漿銅藍蛋白、芳香基酯酶等LAP。在CPLL富集蛋白的過程中，配體珠的性質(大小、密度等)會影響最終的富集結果，因此該實驗還研究了配體珠與血清樣品間的質量比和配體珠大小對檢測蛋白量的影響，結果顯示檢測到的蛋白量隨血清樣品與配體珠間質量比的增加而增加；當保持二者質量比不變，僅增加或減小所使用的配體珠大小時，蛋白的檢測量基本不變。Guerrier等[41]發現在采用CPLL富集人體血清中的LAP時，蛋白的富集量隨緩沖溶液的離子強度和pH值的變化而變化，即血清蛋白與CPLL珠間的結合力與緩沖溶液的離子強度和pH值有關，因此緩沖溶液的配方要依據蛋白樣品的性質而定。Santucci等[42]在采用CPLL富集人體尿液中的LAP之前，先對樣品進行了超速離心、囊泡分離和丁醇沉淀，最后將得到的蛋白進行MS分析。結果顯示相比于未處理樣品(檢測出1 176個尿液蛋白)，從CPLL富集后的人體尿液樣品中檢測出3 429個蛋白，其中有1 724個在尿蛋白質組研究中未曾報道。Candiano等[43]研究了經阿利新藍(Alcian Blue)染料預處理后的CPLL柱對人體尿液中LAP的富集效果。MS分析結果顯示經染料修飾后，CPLL富集后的樣品與前期報道的尿蛋白質組相比，新增加了115個蛋白(包括核苷結合蛋白、催化反應蛋白、陽離子結合蛋白、糖結合蛋白、水解酶活性蛋白和細胞骨架結構成分蛋白等)，該結果表明經染料修飾后的CPLL柱有助于富集樣品中某些特定的LAP。此外,Candiano等[40]、Castagna等[44]、Santucci等[45]還從不同洗脫液組成等其他方面對尿液樣品的CPLL預處理條件進行了優化，證實了不同預處理條件對CPLL富集蛋白作用具有不同程度的影響。

此外，CPLL也可用于富集人腦脊液[46]、膽汁[47]中的LAP。研究表明，人腦脊液的蛋白濃度比人血清蛋白濃度低約500倍，但通過CPLL富集，最終在人腦脊液中鑒定出約800個蛋白[46]。人的膽汁[47]經CPLL富集后共鑒別出新發現的143個蛋白。此外，CPLL還用于富集人體血小板[48-49]、紅細胞[50-52]、骨骼肌[53]和重組單克隆抗體[54]中的LAP，提高了對其蛋白質組的認識水平。

2.2 在動物源蛋白組研究中的應用

一般情況下對人體疾病的研究會先通過相應的動物模型進行初步判斷，因此研究動物模型與人體蛋白質組的異同對人體疾病的診斷及提出相應的治療方案具有指導意義。為了比較卵巢癌雞血液蛋白與人血液蛋白的異同，Ma等[55]研究了卵巢癌雞的血液蛋白質組學。結果顯示與傳統的乙腈分離法相比，CPLL能有效去除雞血液中的HAP，并在卵巢癌雞血液中鑒定出264個蛋白，諸如血液輸送與結合蛋白、免疫與防御相關蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制劑、細胞酶、細胞結構與黏附蛋白，其中血液輸送與結合蛋白、免疫與防御相關蛋白、細胞結構與黏附蛋白等與之前報道的卵巢癌診斷生物標記物種類相同，也與報道的人血液蛋白同源染色體的生物標記物種類相同，此結果為以卵巢癌雞為動物模型的人體卵巢癌疾病的研究提供了參考。此外，豬常被用作心血管疾病研究的動物模型，如Tu等[39]研究了豬血漿的蛋白質組學，結果顯示在豬血漿樣品所鑒定的3 421個蛋白中，55%為采用CPLL富集后的LAP，這些LAP也可成為人體心血管疾病研究中的潛在活性靶標。

Cunsolo等[56]則采用CPLL對山羊奶樣品進行了處理，結果顯示在山羊奶樣品共檢測出的452個蛋白中，其中經CPLL富集的樣品檢測出449個蛋白，是未經CPLL處理樣品的8倍。該結果表明CPLL能顯著提高山羊奶中LAP的檢測數量，在哺乳類動物的蛋白質組研究中有重要作用。張榮春[57]對尖吻蝮蛇毒中的“隱形蛋白質組”進行了研究。結果發現與粗毒(未處理樣品)相比，經CPLL富集后的樣品中10～15 kDa 的HAP含量明顯降低；而30～43 kDa之間豐度較低的LAP得到了富集。另外粗毒中，在20～30 kDa、等電點為7.5～8.5之間基本檢測不出蛋白點，而經CPLL富集后的樣品在此區域呈現出9個特異蛋白點。劉怡君等[58]采用CPLL富集雞蛋清中的LAP，并研究了鹽濃度和pH值對CPLL豐度均衡化效率的影響。結果發現相比于未經處理的蛋清原液，CPLL富集能使蛋清中的蛋白濃度達到豐度均衡化的效果，并且富集效率隨鹽濃度與pH值的變化而變化。Farinazzo等[59]研究了雞蛋黃的蛋白質組學，結果表明經CPLL富集后的樣品鑒別出的蛋白量是未處理樣品的2倍多。此外用CPLL富集海膽體腔液[60]蛋白的研究也發現，在未使用CPLL富集之前只檢測出26個蛋白，而富集后的蛋白點檢測量達到82個。

2.3 在植物源蛋白組研究中的應用

植物中的LAP可能與植物產生抗病毒、抗炎等作用相關，也可能與植物自身的新陳代謝過程有關[4]，因此對植物中LAP的分析和鑒定具有重要意義。植物中LAP的富集方法有PEG分級沉淀法[18-23]等，但CPLL具有去除HAP作用的同時能富集LAP的特殊性質，因而被廣泛應用于植物源蛋白質組的研究，如富集植物中的LAP來分析其對植物生長的影響，檢測植物中的低豐度過敏原以及飲料真實性等。

為了研究金銀花未成熟花芽產生抗炎、抗病毒、抗真菌等生物活性的潛在分子機制，Zhu等[61]分別用CPLL富集法與PEG分級沉淀法處理金銀花未成熟花芽中的蛋白。結果表明，在空白樣品、經CPLL富集后的樣品和經PEG分級沉淀后的樣品中分別檢測出177，614，529個蛋白，僅在采用CPLL富集和PEG分級沉淀后的樣品中檢測出與氧化磷酸戊糖途徑、激素代謝和運輸相關的蛋白。此外，在金銀花未成熟花芽檢測出的所有蛋白中含有28個與次生代謝相關的蛋白。人參因具有抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等多種藥理活性，而作為一種保健中藥被廣泛使用，但對其蛋白成分的研究較少。Colzani等[62]對人參根的蛋白質進行了分析與鑒定，結果顯示，在采用CPLL富集后的人參根中檢測出207個蛋白，其中有55個在人參數據庫中得以匹配，其余的152個在擬南芥數據庫中得以匹配，這些蛋白主要為結構相關酶(19.2%)、氧化還原酶(19.5%)、脫氫酶(7.6%)和合成酶(9%)。為了研究與生物堿合成相關的LAP，章燕珍[3]采用CPLL和雙向電泳技術研究十大功勞葉的蛋白質組。結果顯示相比于未處理樣品，CPLL富集后的樣品檢測出91個新蛋白點、26個差異蛋白點，其中包含血根堿合成酶、異黃酮還原酶和苯丙氨酸解氨酶3個與次生代謝相關的蛋白，同時這些檢測出的蛋白與光合作用、氮代謝和膽固醇代謝等生物代謝過程相關。

植物細胞壁中多糖占90%～95%，蛋白質僅占5%～10%，但這少量的蛋白質在細胞壁的可塑性發育過程和響應環境線索中發揮著重要作用，因此如何富集細胞壁中的蛋白質顯得尤為重要。Nguyen-Kim等[63]采用CPLL和MS技術研究了擬南芥根細胞壁的蛋白質組學。結果發現在擬南芥根細胞壁共檢測出的1 534個蛋白質中，經CPLL富集后的樣品有1 458個(含有大量未曾報道的LAP)，是未富集樣品的2.8倍。此研究是首次利用CPLL研究植物細胞壁的蛋白質組學，證實了CPLL是深入分析細胞壁蛋白質組學的一種有效的樣品前處理方法，可以促進對植物細胞壁蛋白質組的深入研究。另外，Boschetti等[64]采用CPLL富集了玉米種子中的LAP，結果顯示經CPLL富集后的樣品的HAP(如凝集素)含量明顯減少，其蛋白檢測量是未處理樣品的2倍多。此外，CPLL富集技術也應用于菠菜[65]、柏樹花粉[66]、擬南芥葉與南瓜韌皮部[67]、朝鮮薊葉(富含LAP)[68]、寧夏枸杞[69]的蛋白質組學研究。

當人體在攝入非人體組成的外源蛋白后可能產生過敏反應，從而傷害機體的一些正常細胞、組織和器官，嚴重者甚至會威脅到生命安全，因此對于食物中過敏原蛋白(通常含量較低)的檢測顯得尤為重要[70]，食物中的LAP經CPLL富集、雙向電泳分離和MS分析后可使其含有的低豐度過敏原得到檢測與鑒定。Righetti等[71-74]采用上述方法研究了3種熱帶水果(鱷梨、香蕉和芒果)的蛋白質組學特征。結果顯示，在鱷梨果肉[71]檢測出的1 012個蛋白中含有鱷梨過敏原Pers a1，還含有抑制蛋白、聚半乳糖醛酸酶、類甜蛋白、葡聚糖酶和類異黃酮還原酶蛋白等易受過敏原影響的蛋白。在香蕉果肉[72]中檢測出1 131個蛋白(經CPLL富集后的樣品檢測出819個蛋白)，其中包含芭蕉屬a1、果膠酯酶、過氧化物歧化酶等過敏原，還包含降解淀粉顆粒的酶、與成熟期緊密相關的酶。芒果[73]的蛋白質組學分析結果顯示，芒果果皮含有334個蛋白，芒果果肉的蛋白數量高達2 855個，并且經CPLL富集后的果皮與果肉樣品的蛋白檢測量均占總蛋白檢測量的70%以上。芒果中含有非特異性脂質轉運蛋白、過氧化物歧化酶、類小麥萌發素蛋白和抑制蛋白4種過敏原蛋白，其中只在芒果皮中檢測出非特異性脂質轉運蛋白和類小麥萌發素蛋白，這是由于此兩種蛋白與芒果皮的抵御和轉移功能有關。此外，Righetti團隊還分析了檸檬皮與檸檬果肉[75]中的蛋白，結果發現檸檬皮與檸檬果肉分別檢測出1 011個和674個蛋白，其中經CPLL富集后的蛋白檢測數量分別是未處理樣品的8倍和4倍。同時檸檬皮中含有Cit s1、抑制蛋白和Cit s3三種過敏原蛋白，檸檬果肉中也含有Cit s1和Cit s2兩種過敏原蛋白。Esteve等[76]也采用相同方法分析了橄欖果肉和橄欖種子的蛋白質組學特征，結果發現在橄欖種子檢測出的61個蛋白中含有種子儲藏蛋白、油脂蛋白和組蛋白等LAP，在橄欖果肉檢測出的231個蛋白中含有類奇異果甜蛋白過敏原。

由于飲料中的蛋白含量相對較低，必須通過富集才能檢測其中的蛋白質，通常可通過CPLL富集、雙向電泳分離及MS分析飲料中的蛋白。Righetti團隊最早將CPLL富集技術用于酒精性飲料中的蛋白質檢測，采用上述方法分析了啤酒[77]中的蛋白，結果發現所檢測的啤酒含有20個不同的大麥蛋白、40個啤酒酵母菌蛋白、1個貝酵母菌蛋白、1個巴氏酵母菌蛋白和2個玉米蛋白，該結果表明所檢測的啤酒可能由大麥和玉米經過多重發酵制得。隨后Righetti等[78-79]用CPLL分別富集了白葡萄酒和意大利紅葡萄酒中的LAP，結果發現二者的酪蛋白濃度分別為1 μg/L和3.8 μg/L，均符合檢驗要求，還發現意大利紅葡萄酒中含有屬于釀酒酵母和植物病原體與真菌(如灰葡萄孢霉、核盤菌和棘孢曲霉)的LAP。為了驗證商業酒的真實性，Righetti等對比了自制白酒和商業西娜爾利口酒[68]、自制檸檬酒和市售檸檬酒[75]中的蛋白組分。結果發現在自制的白酒中檢測出18個在西娜爾利口酒中未檢測出的蛋白；自制檸檬酒含有24個蛋白，而市售檸檬酒僅含有8個蛋白。另有研究對開胃酒(AmaroBraulio)[80-81]和香檳酒[82]中的蛋白進行了分析，結果顯示在開胃酒檢測出的93個蛋白中，除33個蛋白未歸屬外，其余60個蛋白(含部分共有蛋白)中，6個屬于蜂蜜、11個屬于橙皮、29個屬于龍膽屬藤黃、46個屬于當歸蘆荀；在香檳酒檢測的43個蛋白中，12個屬于釀酒葡萄、7個屬于釀酒酵母，其余屬于綠色植物有機體。

CPLL還可用于富集非酒精性飲料中的LAP。例如，杏仁乳和杏仁糖漿[83]、椰奶[84]、可樂[85]、姜汁[86]、橄欖油[87]、白葡萄醋[88]和口服補液[89]中的LAP通過CPLL富集得到了很好的檢測。經CPLL富集后在杏仁乳中[83]檢測出了137個蛋白，含有脂質轉移蛋白過敏原和鈣調蛋白、抑制蛋白、Pru2蛋白和磷酸甘油醛脫氫酶等潛在過敏原，在杏仁糖漿中檢測出了14個蛋白均屬于苦杏仁提取物，以此證明了杏仁糖漿原料的來源。椰奶[84]的蛋白質組學分析顯示，在椰奶檢測出的307個蛋白中有200個是通過CPLL富集后得到。為了驗證可樂飲料的原料是否來源于植物常青樹堅果(可樂果)，D’Amato等[85]采用CPLL富集可樂飲料中的LAP，結果顯示經CPLL富集后，在1 L裝的可樂飲料中檢測出屬于可樂果和龍舌蘭的分子量在15～20 kDa范圍的LAP，此結果與該飲料商業標簽中公布的信息一致(飲料中摻入6%的龍舌蘭糖漿)。而姜汁[86]的分析結果顯示，檢出5個葡萄蛋白和1個蘋果蛋白，未檢測出任何生姜蛋白，但味覺測試(舌頭有辛辣刺痛感)證明有生姜提取物的存在，未檢測出生姜蛋白是因為相對于葡萄汁和蘋果汁的存在，生姜提取物的含量太低。橄欖油[87]的蛋白檢測結果顯示，橄欖油含有組蛋白H4和細胞色素P450等3個來源于植物的蛋白，也含有7個來源于細菌的蛋白。此前已有研究者對CPLL富集技術在食品分析中的應用進行了綜述[90-92]，這些研究將為CPLL應用于更多的食品分析提供參考。

3 總結與展望

LAP是生物體各種生物過程的重要蛋白，參與到生命活動過程中的各個方面，因而對生物體的LAP進行研究具有十分重要的意義。CPLL是富集LAP的有效方法之一，如前所述CPLL在人體、動物源和植物源等蛋白組研究中已有廣泛的應用。然而，有研究[27,46]報道在CPLL富集蛋白的過程中會出現“蛋白損失”的情況，即原始粗提物中的某些蛋白在經CPLL富集后會“損失”，從而影響這些蛋白的檢測。出現這種現象主要有以下原因：①不是所有蛋白均能與配體庫相匹配；②洗脫時的洗脫條件不足以破壞蛋白與CPLL間較強的相互作用力，導致部分蛋白還保留在CPLL柱上；③洗脫條件破壞了蛋白與CPLL間較弱的相互作用力，導致部分蛋白隨洗脫液被洗脫；④某些次級代謝物可能干擾部分蛋白的結合與洗脫。此外，對樣品進行處理時，商品化CPLL柱要求蛋白進入量為10～50 mg[33]，一般而言提純后的蛋白輸出量(通常是進入量的2%～5%)足夠用于后續的蛋白分析，但對大多數植物蛋白樣品而言，高濃度的蛋白進入量要求較難達到。另外，研究[27]發現HAP被飽和后，洗脫掉未結合的HAP使得這些HAP不能被定量。同時LAP的模擬實驗也顯示只有CPLL珠不被飽和，樣品中的蛋白方能進行定量分析[93]，亦即被飽和的蛋白不能進行定量分析。

針對上述局限性，為提高CPLL的富集率，有研究[47,94]顯示，在不影響CPLL的整體富集效率時，適當減小CPLL珠的體積可以相應減少蛋白的進樣量。同時研究[60]發現在用CPLL富集植物樣品的蛋白前，先使用酚萃取和丙酮洗滌等步驟除去植物蛋白中的次級代謝物，將使得CPLL的蛋白富集效果得到顯著提高。此外也有研究[95-96]顯示在不同pH值條件下CPLL可選擇性富集陽離子蛋白或陰離子蛋白，低離子強度與高離子強度下的富集結果也有所不同，而易溶鹽條件有利于富集疏水性蛋白，分餾解吸條件有利于提高蛋白的檢測量。

近年來，隨著CPLL的發展，蛋白質組和基因組的研究已經緊密相連，這不僅促進了基因組的發展，同時也將推動蛋白質組分析的發展。經CPLL富集后的蛋白在進行2-D電泳分離后，其差異蛋白可再進行MS分析，主要有以下方式：①基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜測量法(MALDI-TOF MS)，鑒定該多肽源自何種蛋白，即多肽質量指紋分析。②電噴霧電離質譜測量法(ESI-MS)，通過數據庫檢索到的質譜獲得多肽的氨基酸序列，從而使蛋白的鑒定更準確可靠。③表面增強激光解析離子化-飛行時間質譜技術(SELDI-TOF MS)，該技術適合不同來源的樣品比較。④傅立葉變換-離子回旋共振質譜法(FTICR-MS)，該方法便于實現串聯質譜分析，可完成多級串聯質譜分析。總之，CPLL已成為目前蛋白質組學研究領域中應用最多的一種LAP富集技術，而2-D電泳和MS分析則成為分離和鑒定蛋白最為重要的技術。

[1] Wilkins M R,Sanchez J C,Gooley A A,Appel R D,Humphery-Smith I,Hochstrasser D F,Williams K L.Biotechno.Gene.Eng.Rev.,1996,13:19-50.

[2] Garrels J I,McLaughlin C S,Warner J R,Futcher B,Latter G I,Kobayashi R,Schwender B,Volpe T,Anderson D S,Mesquita-Fuentes R,Payne W E.Electrophoresis,1997,18(8):1347-1360.

[3] Zhang Y Z.TheInductionofAlkaloidsinMahoniaBealeiLeavesandtheCorrelatedProteomicsAnalysis.Hangzhou:Zhejiang University(章燕珍.闊葉十大功勞葉中生物堿的紫外誘導及相關蛋白質組學分析.杭州:浙江大學),2014.

[4] Li C H,Chen C,Xia Z N,Yang F Q.Chin.J.Chin.Mater.Med.(李春紅,陳岑,夏之寧,楊豐慶.中國中藥雜志),2015,40(13):2508-2517.

[5] Kelly M A,McLellan T J,Rosner P J.Anal.Chem.,2002,74(1):1-9.

[6] Tsikas D.J.Biochem.Biophys.Methods,2001,49(1/3):705-731.

[7] Guillemin I,Becker M,Ociepka K,Friauf E,Nothwang H G.Proteomics,2005,5(1):35-45.

[8] Jiang X S,Zhou H,Zhang L,Sheng Q H,Li S J,Li L,Hao P,Li Y X,Xia Q C,Wu J R,Zeng R.Mol.Cell.Proteomics,2004,3(5):441-455.[9] Kachman M T,Wang H X,Schwartz D R,Cho K R,Lubman D M.Anal.Chem.,2002,74(8):1779-1791.

[10] Westman-Brinkmalm A,Davidsson P.Anal.Biochem.,2002,301(2):161-167.

[11] Xi J H,Wang X,Li S Y,Zhou X,Yue L,Fan J,Hao D Y.Phytochemistry,2006,67(21):2341-2348.

[12] Gou L M,Shao X B,Li K.Chin.J.Clin.Lab.Sci.(茍黎明,邵小寶,李克.臨床檢驗雜志),2010,28(4):298-300.[13] Yang K G,Zhang L H,Zhang Y K.J.ZhengzhouUniv.LightInd.：Nat.Sci.(楊開廣,張麗華,張玉奎.鄭州輕工業學院學報：自然科學版),2012,27(5):1-8.

[14] Zhang X Q,Jiang Y,Li Y M,He F C.Chin.J.Lab.Med.(張雪群,姜穎,厲有名,賀福初.中華檢驗醫學雜志),2006,29(10):947-950.

[15] Ma M L,Zeng J Y,Ma J,Yuan H X,Niu T,Liao S Q.GansuMed.J.(馬梅蘭,曾家豫,馬瑾,袁紅霞,牛童,廖世奇.甘肅醫藥),2016,35(1):4-6.

[16] Kong H J,Zhang K S,Liu Y J,Shang Y J,Wu B,Liu X T.Prog.Vet.Med.(孔漢金,張克山,劉永杰,尚佑軍,吳斌,劉湘濤.動物醫學進展),2013,34(6):167-171.

[17] Fountoulakis M,Juranville J F.Anal.Biochem.,2003,313(2):267-282.

[18] Lu X J,Zhang X L,Liu G L,Li T L.Sci.SilvaeSin.(陸秀君,張曉林,劉廣林,李天來.林業科學),2013,49(11):189-194.

[19] Wang Y,Cui W T,Yang M F,Shen S H.ActaPratacultUraeSin.(王瑩,崔為同,楊明峰,沈世華.草業學報),2011,20(3):192-197.

[20] Aryal U K,Krochko J E,Ross A R.J.ProteomeRes.,2012,11(1):425-437.

[21] Chen X,Chan W L,Zhu F Y,Lo C.ProteomeSci.,2014,12(16):1-14.

[22] Zhu W,Hu J,Wang X,Tian J K,Komatsu S.J.ProteomeRes.,2015,14(6):2669-2685.

[23] Wang W Q,Song B Y,Deng Z J,Wang Y,Liu S J,Moller I M,Song S Q.PlantPhysiol.,2015,167(4):1332-1350.[24] Furka A,Sebestyen F,Asgedom M,Dibo G.Int.J.PeptideProteinRes.,1991,37(6):487-493.

[25] Lam K S,Salmon S E,Hersh E M,Hruby V J,Kazmierski W M,Knapp R J.Nature,1991,354(6348):82-84.

[26] Turk B E,Cantley L C.Curr.Opin.Chem.Biol.,2003,7(1):84-90.

[27] Thulasiraman V,Lin S,Gheorghiu L,Lathrop J,Lomas L,Hammond D,Boschetti E.Electrophoresis,2005,26(18):3561-3571.

[28] Boschetti E,Righetti P G.J.Proteomics,2008,71(3):255-264.

[29] Righetti P G,Boschetti E.MassSpectrom.Rev.,2008,27(6):596-608.

[30] Righetti P G,Boschetti E,Candiano G.J.Proteomics,2012,75(15):4783-4791.

[31] Righetti P G.J.Proteomics,2014,107:39-49.

[32] Righetti P G,Candiano G,Citterio A,Boschetti E.Anal.Chem.,2015,87(1):293-305.

[33] Li J S,Sun R Q.ForeignMed.：Sec.Sci.Biol.Proph.Diagn.Ther.(李勁松,孫潤橋.《國外醫學》：預防、診斷、治療用生物制品分冊),1998,21(1):22-26.

[34] Frohlich A,Lindermayr C.J.Proteomics,2011,74(8):1182-1189.

[35] Zhang Y.ProteomicProfilingofCandidateBiomarkersinUrineofNon-smallCellLungCancerPatients.Chongqing:Chongqing Medical University(張淵.非小細胞肺癌患者尿液中潛在生物標志物的研究.重慶:重慶醫科大學),2011.

[36] Bruschi M,Candiano G,Santucci L,D’Ambrosio C,Scaloni A,Bonsano M,Ghiggeri G M,Verrina E.J.Proteomics,2015,116:68-80.[37] Selvaraju S,Rassi Z E.J.Chromatogr.B,2014,951/952:135-142.

[38] Santucci L,Candiano G,Petretto A,Lavarello C,Bruschi M,Ghiggeri G M,Citterio A,Righetti P G.J.Chromatogr.A,2013,1297:106-112.[39] Tu C J,Li J,Young R,Page B J,Engler F,Halfon M S,Canty J M,Jr,Qu J.Anal.Chem.,2011,83(12):4802-4813.

[40] Candiano G,Santucci L,Bruschi M,Petretto A,D’Ambrosio C,Scaloni A,Righetti P G,Ghiggeri G M.J.Proteomics,2012,75(3):796-805.[41] Guerrier L,Thulasiraman V,Castagna A,Fortis F,Lin S.J.Chromatogr.B,2006,833(1):33-40.

[42] Santucci L,Candiano G,Petretto A,Bruschi M,Lavarello C,Inglese E,Righetti P G,Ghiggeri G M.J.Proteomics,2015,112:53-62.

[43] Candiano G,Santucci L,Petretto A,Lavarello C,Inglese E,Bruschi M,Ghiggeri G M,Boschetti E,Righetti P G.Anal.Chem.,2015,87(9):4814-4820.

[44] Castagna A,Cecconi D,Sennels L,Rappsilber J,Guerrier L,Fortis F,Boschetti E,Lomas L,Righetti P G.J.ProteomeRes.,2005,4(6):1917-1930.

[45] Santucci L,Candiano G,Bruschi M,D’Ambrosio C,Petretto A,Scaloni A,Urbani A,Righetti P G,Ghiggeri G M.Proteomics,2012,12(4/5):509-515.

[46] Mouton-Barbosa E,Roux-Dalvai F,Bouyssie D,Berger F,Schmidt E,Righetti P G,Guerrier L,Boschetti E,Burlet-Schiltz O,Monsarrat B,Peredo A G.Mol.Cell.Proteomics,2010,9(5):1006-1021.

[47] Guerrier L,Claverol S,Finzi L,Paye F,Fortis F,Boschetti E,Housset C.J.Chromatogr.A,2007,1176(1/2):192-205.

[48] Guerrier L,Claverol S,Fortis F,Rinalducci S,Timperio A M,Antonioli P,Jandrot-Perrus M,Bochetti E,Righetti P G.J.ProteomeRes.,2007,6(11):4290-4303.

[49] Sihlbom C,Kanmert I,Bahr H,Davidsson P.J.ProteomeRes.,2008,7(9):4191-4198.

[50] Simo C,Bachi A,Cattaneo A,Guerrier L,Fortis F,Boschetti E,Podtelejnikov A,Righetti P G.Anal.Chem.,2008,80(10):3547-3556.

[51] Bachi A,Simo C,Restuccia U,Guerrier L,Fortis F,Boschetti E,Masseroli M,Righetti P G.Anal.Chem.,2008,80(10):3557-3565.

[52] Roux-Dalvai F,Peredo A G,Simo C,Guerrier L,Bouyssie D,Zanella A,Citterio A,Burlet-Schiltz O,Boschetti E,Righetti P G,Monsarrat B.Mole.Cell.Proteomics,2008,7(11):2254-2269.

[53] Rivers J,Hughes C,McKenna T,Woolerton Y,Vissers J P C.Langridge J I,Beynon R J.PLoSOne,2011,6(12):e28902.

[54] Antonioli P,Fortis F,Guerrier L,Rinalducci S,Zolla L,Righetti P G,Boschetti E.Proteomics,2007,7(10):1624-1633.

[55] Ma Y Y,Sun Z Y,Matos R,Zhang J,Odunsi K,Lin B Y.OMICS,2014,18(5):280-297.

[56] Cunsolo V,Fasoli E,Saletti R,Muccilli V,Gallina S,Righetti P G,Foti S.J.Proteomics,2015,128:69-82.

[57] Zhang R C.UsingCombinatorialPeptideLigandLibrary(CPLL)ApproachesinExploringtheVenomHiddenProteomeofAgkistrodonAcutusVenom.Chongqing:Chongqing Normal University(張榮春.用組合肽配體庫技術(Combinatorial Peptide Ligand Library,CPLL)對尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)毒的“隱形蛋白質組”的研究.重慶:重慶師范大學),2014.

[58] Liu Y J,Qiu N,Ma M H.J.Instrum.Anal.(劉怡君,邱寧,馬美湖.分析測試學報),2015,34(11):1259-1265.[59] Farinazzo A,Restuccia U,Bachi A,Guerrier L,Fortis F,Boschetti E,Fasoli E,Citterio A,Righetti P G.J.Chromatogr.A,2009,1216(8):1241-1252.[60] Fasoli E,D’Amato A,Righetti P G,Barbieri R,Bellavia D.Biol.Bull.,2012,222(2):93-104.

[61] Zhu W,Xu X B,Tian J K,Zhang L,Komatsu S.J.ProteomeRes.,2016,15(1):166-181.

[62] Colzani M,Altomare A,Caliendo M,Aldini G,Righetti P G,Fasoli E.J.Proteomics,2016,130:150-159.

[63] Nguyen-Kim H,Clemente H S,Balliau T,Zivy M,Dunand C,Albenne C,Jamet E.Proteomics,2016,16(3):491-503.

[64] Boschetti E,Bindschedler L V,Tang C R,Fasoli E,Righetti P G.J.Chromatogr.A,2009,1216(8):1215-1222.

[65] Fasoli E,D’Amato A,Kravchuk A V,Boschetti E,Bachi A,Righetti P G.J.Proteomics,2011,74(1):127-136.

[66] Shahali Y,Sutra J P,Fasoli E,D’Amato A,Righetti P G,Futamura N,Boschetti E,Senechal H,Poncet P.J.Proteomics,2012,77:101-110.

[67] Frohlich A,Gaupels F,Sarioglu H,Holzmeister C,Spannagl M,Durner J,Lindermayr C.PlantPhysiol.,2012,159(3):902-914.

[68] Saez V,Fasoli E,D’Amato A,Simo-Alfonso E,Righetti P G.Biochim.Biophys.Acta,2013,1834(1):119-126.

[69] D’Amato A,Esteve C,Fasoli E,Citterio A,Righetti P G.Electrophoresis,2013,34(12):1729-1736.

[71] Esteve C,D’Amato A,Marina M L,Garcia M C,Righetti P G.Electrophoresis,2012,33(18):2799-2805.

[72] Esteve C,D’Amato A,Marina M L,Garcia M C,Righetti P G.Electrophoresis,2013,34(2):207-214.

[73] Fasoli E,Righetti P G.Biochim.Biophys.Acta,2013,1834(12):2539-2545.

[74] Righetti P G,Esteve C,D’Amato A,Fasoli E,Marina M L,Garcia M C.Proteomics,2015,15(10):1639-1645.

[75] Fasoli E,Colzani M,Aldini G,Citterio A,Righetti P G.Biochim.Biophys.Acta,2013,1834(8):1484-1491.

[76] Esteve C,D’Amato A,Marina M L,Garcia M C,Citterio A,Righetti P G.J.Proteomics,2012,75(8):2396-2403.[77] Fasoli E,Aldini G,Regazzoni L,Kravchuk A V,Citterio A,Righetti P G.J.ProteomeRes.,2010,9(10):5262-5269.

[78] Cereda A,Kravchuk A V,D’Amato A,Bachi A,Righetti P G.J.Proteomics,2010,73(9):1732-1739.

[79] D’Amato A,Kravchuk A V,Bachi A,Righetti P G.J.Proteomics,2010,73(12):2370-2377.

[80] Fasoli E,D’Amato A,Citterio A,Righetti P G.J.Proteomics,2012,75(11):3374-3379.

[81] Lerma-Garcia M J,D’Amato A,Fasoli E,Simo-Alfonso E F,Gighetti P G.Biochim.Biophys.Acta,2014,1844(9):1493-1499.

[82] Cilindre C,Fasoli E,D’Amato A,Liger-Belair G,Righetti P G.J.Proteomics,2014,105:351-362.

[83] Fasoli E,D’Amato A,Kravchuk A V,Citterio A,Righetti P G.J.Proteomics,2011,74(7):1080-1090.

[84] D’Amato A,Fasoli E,Righetti P G.J.Proteomics,2012,75(3):914-920.

[85] D’Amato A,Fasoli E,Kravchuk A V,Righetti P G.J.ProteomeRes.,2011,10(5):2684-2686.

[86] Fasoli E,D’Amato A,Citterio A,Righetti P G.J.Proteomics,2012,75(6):1960-1965.

[87] Esteve C,D’Amato A,Marina M L,Garcia M C,Righetti P G.J.Agric.FoodChem.,2013,61(43):10384-10391.[88] Girolamo F D,D’Amato A,Righetti P G.J.Proteomics,2011,75(2):718-724.

[89] Krief G,Deutsch O,Zaks B,Wong D T,Aframian D J,Palmon A.J.Proteomics,2012,75(13):4165-4175.

[90] Boschetti E,Righetti P G.Electrophoresis,2012,33(15):2228-2239.

[91] Agrawal G K,Sarkar A,Righetti P G,Pedreschi R,Carpentier S,Wang T,Barkla B J,Kohli A,Ndimba B K,Bykova N V,Rampitsch C,Zolla L,Rafudeen M S,Cramer R,Bindschedler L V,Tsakirpaloglou N,Ndimba R J,Farrant J M,Renaut J,Job D,Kikuchi S,Rakwal R.MassSpectrom.Rev.,2013,32(5):335-365.

[92] Righetti P G,Fasoli E,D’Amato A,Boschetti E.Foods,2014,3(2):217-237.

[93] Hartwig S,Czibere A,Kotzka J,Passlack W,Haas R,Eckel J,Lehr S.Arch.Physiol.Biochem.,2009,115(3):155-160.

[94] Li L,Sun C J,Freeby S,Yee D,Kieffer-Jaquinod S,Guerrier L,Boschetti E,Lomas L.J.ProteomicsBioinf.,2009,2(12):485-494.

[95] Keidel E M,Ribitsch D,Lottspeich F.Proteomics,2010,10(11):2089-2098.

[96] Righetti P G,Fasoli E,D’Amato A,Boschetti E.Compr.Anal.Chem.,2014,64:131-155.

Progress in Research of Combinatorial Peptide Ligand Libraries for Protein Enrichment

FAN Jiao-jiao1,LI Su-ying2,LI Chun-hong1,CHEN Hua1,XIA Zhi-ning1,YANG Feng-qing1*

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University,Chongqing 400031,China; 2.Department of Pharmacy,Henan Medical College,Zhengzhou 451191,China)

The low-abundance proteins play an important role in the biological activity of living organisms,involving in many physiological or pathological processes,such as metabolism,transcription and translation.Therefore,the analysis and identification of low-abundance proteins are vital in the study of proteomics.Combinatorial peptide ligand library(CPLL) is an effective method for the enrichment of low-abundance proteins,and the detection and identification of low-abundance proteins could be achieved after treated by CPLL.According to studies on the CPLL reported in recent years,its applications in different fields including the studies on low-abundance proteins in human,animal and plant protein samples were reviewed.The main purpose of this review is to provide a reference for future researches and applications of CPLL.

low-abundance proteins;combinatorial peptide ligand library;proteomics;research progress;review

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.024

2016-07-11；

2016-07-27

國家自然科學基金項目(81202886，21275169)

*通訊作者：楊豐慶，博士，教授，研究方向：藥物分析、色譜分析，Tel:13617650637，E-mail:fengqingyang@cqu.edu.cn

O629.7;O657.7

A

1004-4957(2017)01-0136-09