超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析不同加工何首烏中差異化學(xué)成分

羅益遠(yuǎn)，劉娟秀，劉訓(xùn)紅*，王勝男，華愉教，蘭才武，邢清清

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023;2.貴州昌昊中藥發(fā)展有限公司 研發(fā)部，貴州 凱里 556000)

超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析不同加工何首烏中差異化學(xué)成分

羅益遠(yuǎn)1，劉娟秀1，劉訓(xùn)紅1*，王勝男1，華愉教1，蘭才武2，邢清清1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023;2.貴州昌昊中藥發(fā)展有限公司 研發(fā)部，貴州 凱里 556000)

建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)對(duì)不同加工何首烏中化學(xué)成分差異的分析方法。何首烏樣品采用甲醇在室溫下超聲提取后，采用UPLC-QTOF-MS進(jìn)行分析，對(duì)采集的圖譜通過(guò)峰匹配、峰對(duì)齊、濾噪處理等進(jìn)行特征峰提取，然后用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，不同加工何首烏樣品間的化學(xué)組成存在顯著性差異；根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合軟件數(shù)據(jù)庫(kù)搜索及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行成分鑒定，初步篩選并鑒定出33種不同加工何首烏間差異顯著的化學(xué)成分，其中15種為共有差異化學(xué)成分，并呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。研究結(jié)果可為揭示不同加工方法對(duì)何首烏代謝產(chǎn)物差異性的影響規(guī)律提供依據(jù)。

何首烏；超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS);加工方法；差異化學(xué)成分

何首烏為大宗常用中藥材，系蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥塊根，具有消癰、解毒、截瘧、潤(rùn)腸通便的功效，主要用于瘡癰、瘰疬、風(fēng)疹瘙癢、久瘧體虛、腸燥便秘[1]。現(xiàn)代研究表明，何首烏具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、保肝、止痛抗菌等作用[2-3]。藥材產(chǎn)地加工是藥材生產(chǎn)與品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，由于何首烏產(chǎn)地加工方法和條件不一，無(wú)規(guī)范化的技術(shù)指南，存在一定的隨意性，造成何首烏有效成分的變化，藥材質(zhì)量參差不齊[4]，難以實(shí)現(xiàn)商品藥材標(biāo)準(zhǔn)化及保證其臨床使用有效性。如何篩選適宜的加工方法已成為何首烏生產(chǎn)過(guò)程中的重要問(wèn)題。目前對(duì)何首烏藥材加工方法及其質(zhì)量的評(píng)價(jià)研究，主要集中在二苯乙烯苷類(lèi)、蒽醌類(lèi)成分的分析，多以單一或單類(lèi)成分的含量或動(dòng)態(tài)變化為考察指標(biāo)[5-7]，尚少見(jiàn)對(duì)不同加工何首烏化學(xué)成分的整體變化或顯著差異化學(xué)成分的研究報(bào)道。

植物代謝組學(xué)技術(shù)是對(duì)植物提取物中代謝物進(jìn)行高通量、無(wú)偏差全面分析的技術(shù)，特別適合于中藥中多組分復(fù)雜體系的分析[8-9]，使中藥研究更符合我國(guó)醫(yī)學(xué)的整體觀念。相對(duì)于傳統(tǒng)的液相分離方法，超高效液相色譜(UPLC)對(duì)代謝物的檢測(cè)更為簡(jiǎn)便、快速且效率更高， 除了對(duì)代謝物的分離檢測(cè)外，未知代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定也是UPLC-MS 的又一特點(diǎn)[10-13]。本文在前期研究基礎(chǔ)上[14-19]，借鑒植物代謝組學(xué)的研究思路和方法，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)技術(shù)分析了不同加工何首烏化學(xué)成分的差異性，并通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析找出差異顯著的化學(xué)成分及其變化規(guī)律，旨在為揭示不同加工方法對(duì)何首烏代謝產(chǎn)物的影響規(guī)律以及探討何首烏藥材的品質(zhì)形成機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

AquityTMUPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);Triple TOFTM5600 System- MS/MS電噴霧飛行時(shí)間高分辯質(zhì)譜儀、Peakview 1.2數(shù)據(jù)處理工作站(美國(guó)AB Sciex公司);SIMCA-P 13.0數(shù)據(jù)處理軟件(瑞士Umetrics公司);Anke TGL-16B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);BSA224S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司);KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz)。甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)，用于色譜流動(dòng)相配制；甲酸(色譜純，德國(guó)Merck公司);甲醇(化學(xué)純，南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：081110865)，用于供試品溶液制備；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(由Millipore純水器制備)。

何首烏樣品為2013年10月采自貴州省赫章縣平山鄉(xiāng)中山村栽培基地(2年生植株)，洗凈，分別進(jìn)行曬干和40～80 ℃烘干不同加工處理。所有樣品均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥塊根。留樣憑證保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試品溶液制備

取不同加工何首烏樣品，粉碎，過(guò)80目篩。精密稱(chēng)取干燥恒重的樣品粉末1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱(chēng)重，室溫下超聲提取45 min后取出，放冷以甲醇補(bǔ)足失重，靜置冷卻，4 ℃保存，12 000 r/min離心10 min，取出上清液過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，即得。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流動(dòng)相：甲醇(A)- 0.1%甲酸的水(B);梯度洗脫程序：0～3 min，20%～35% A；3～10 min，35%～45% A；10～15 min，45%～60% A；15～20 min，60%～80% A；20～30 min，80%～100% A。流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000；噴霧電壓5.0 kV；氣簾氣30 L/min；霧化氣55 L/min；輔助氣55 L/min；離子源溫度500 ℃；碰撞室射出電壓(CXP)9 V；去簇電壓(DP)100 V。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)和色譜圖導(dǎo)入Peakview 1.2數(shù)據(jù)處理工作站進(jìn)行峰匹配、峰對(duì)齊、濾噪處理等，結(jié)果保存導(dǎo)入SIMCA-P 13.0進(jìn)行分析。采用主成分分析(PCA)，初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達(dá)不同加工何首烏的化學(xué)組成差異；隨后以偏最小二乘判別分析(PLS-DA)分別對(duì)各樣品進(jìn)行分類(lèi)，其中R2X和R2Y越接近1，表示模型越穩(wěn)定，Q2>0.5表示預(yù)測(cè)率高。根據(jù)PLS-DA模型得到的變量權(quán)重值(VIP>1)找到潛在的差異化學(xué)成分。采用t檢驗(yàn)，驗(yàn)證多維統(tǒng)計(jì)中找到的差異化學(xué)成分是否在單維統(tǒng)計(jì)中具有顯著性差異，其中P<0.05表示有顯著性差異。

圖1 不同加工何首烏樣品的提取離子流(BPI)色譜圖Fig.1 UPLC-QTOF-MS base peak intensity(BPI) chromatogram of Polygoni Multifori Radix processed by different methodsA.sun drying；B.40 ℃ drying；C.70 ℃ drying;the number denoted was the same as that in Table 1

1.5 差異化學(xué)成分的鑒定

通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜確定精確相對(duì)分子質(zhì)量，二級(jí)質(zhì)譜獲得裂解信息，結(jié)合HMDB(http://www.hmdb.ca

/)和METLIN(http://metlin.Scripps.edu /)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索及已報(bào)道文獻(xiàn)推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)式信息。差異成分的量以各樣品對(duì)應(yīng)的峰面積表示，通過(guò)對(duì)不同加工何首烏樣品間同一物質(zhì)峰面積的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算，得到差異化學(xué)成分在不同加工樣品間的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的選擇分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水及梯度洗脫條件下對(duì)樣品中各峰分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時(shí)，各峰的峰形較好且有良好的分離效果。根據(jù)設(shè)定的色譜-質(zhì)譜條件，取不同加工何首烏樣品(曬干品、 40 ℃烘干品、 50 ℃烘干品、60 ℃烘干品、70 ℃烘干品和80 ℃烘干品)供試品溶液進(jìn)樣分析。圖1為不同加工(曬干,40 ℃烘干,70 ℃烘干)下何首烏樣品在負(fù)離子模式下的UPLC-Triple TOF-MS/MS基峰強(qiáng)度離子流(BPI)色譜圖。

圖2 不同加工何首烏在負(fù)離子模式下的PCA得分圖Fig.2 PCA plot of Polygoni Multifori Radix processed by different methods in negative ion modesun drying；▼40 ℃ drying；●50 ℃ drying；■60 ℃ drying；◆70 ℃ drying；▲80 ℃ drying

2.2 樣品處理方法的優(yōu)化

供試品溶液制備中分別考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇3種溶劑，超聲提取后發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑的色譜峰峰形優(yōu)于其它兩種溶劑。并考察了超聲提取時(shí)間(15，30，45，60 min)的影響，結(jié)果表明超聲提取45 min時(shí)的相對(duì)峰面積明顯較大，因此最終選擇以甲醇溶液超聲提取45 min。

2.3 PCA分析

采用PCA對(duì)6種加工何首烏樣品進(jìn)行降維分析。圖2為6種不同加工何首烏PCA分析的散點(diǎn)圖(t[1]：58.1%；t[2]：17.6%)。從圖2中可以看出，不同加工何首烏的樣品在PCA軸上呈逐步變化的趨勢(shì)，不同加工何首烏樣品的分類(lèi)結(jié)果較為理想，說(shuō)明6種不同加工的何首烏樣品的化學(xué)成分存在明顯差異。曬干品和烘干品何首烏的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明曬干品和烘干品何首烏中的化學(xué)成分差異明顯。40 ℃烘干和50 ℃烘干的何首烏樣品距離較近，60 ℃烘干、70 ℃烘干和80 ℃烘干的何首烏樣品相距也較近，說(shuō)明40 ℃烘干與50 ℃烘干的何首烏樣品化學(xué)成分差異不明顯，60 ℃烘干、70 ℃烘干和80 ℃烘干的何首烏樣品化學(xué)成分差異不明顯，但與曬干品相比，化學(xué)成分均有顯著差異。

2.4 PLS-DA分析

首先對(duì)曬干組何首烏樣品與低溫烘干組(40 ℃烘干、50 ℃烘干)何首烏樣品進(jìn)行了PLS-DA分析(圖3A)。兩組加工何首烏樣品沿著PC1軸明顯分開(kāi)，模型驗(yàn)證結(jié)果(R2Y=0.996，Q2=0.985)顯示模型可靠，與無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析(PCA)相比，兩組加工何首烏樣品得到更大程度的分離，且有助于尋找差異的化學(xué)成分。VIP的得分圖(圖3B)和有效對(duì)應(yīng)的柱狀載荷圖(圖3C)顯示，對(duì)兩組分類(lèi)貢獻(xiàn)較大的差異性成分(VIP>1)共有126個(gè)特征峰。

圖3 曬干組(a)和低溫烘干組(b)的何首烏樣品的PLS-DA得分圖(A)、VIP得分圖(B)和柱狀載荷圖(C)

對(duì)曬干組和高溫烘干組(60 ℃烘干、70 ℃烘干和80 ℃烘干)的何首烏樣品進(jìn)行PLS-DA分析，兩組加工何首烏樣品在其得分圖中可以明顯區(qū)分(圖4A)。模型驗(yàn)證結(jié)果顯示其有效可靠(R2Y=0.998，Q2=0.992)。兩種加工何首烏樣品的VIP得分圖(圖4B)和柱狀載荷圖(圖4C)顯示，VIP>1的共有118個(gè)特征峰。

圖4 曬干組(a)和高溫烘干組(c)的何首烏樣品的PLS-DA得分圖(A)、VIP得分圖(B)和柱狀載荷圖(C)

最后對(duì)低溫烘干組(40 ℃烘干、50 ℃烘干)和高溫烘干組(60 ℃烘干、70 ℃烘干和80 ℃烘干)的何首烏樣品進(jìn)行PLS-DA分析，在得分圖中兩種加工的樣品可以明顯分開(kāi)(圖5A)。模型驗(yàn)證結(jié)果(R2Y=0.997，Q2=0.990)顯示其有效可靠。同樣對(duì)其VIP得分圖(圖5B)和柱狀載荷圖(圖5C)進(jìn)行考察，VIP>1的共有124個(gè)特征峰。

圖5 低溫烘干組(b)和高溫烘干組(c)的何首烏樣品的PLS-DA得分圖(A)、VIP得分圖(B)和柱狀載荷圖(C)

2.5 差異化學(xué)成分鑒定

通過(guò)HMDB和METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)[20-27]搜索差異化學(xué)成分的精準(zhǔn)質(zhì)荷比，對(duì)VIP>1且P<0.05的差異化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(結(jié)果見(jiàn)表1)，初步鑒定出33個(gè)化學(xué)成分。其中不同加工何首烏樣品中共有15個(gè)差異化學(xué)成分，分別為：3,5-二羥苯基-1-O-β-D-(6″-O-沒(méi)食子酰)-吡喃葡萄糖苷、沒(méi)食子酸、原始車(chē)菊素B-7-3-O沒(méi)食子酰、兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、2-甲基-5-羧甲基-7-羥基對(duì)氧萘酮、二苯乙烯苷、大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷、決明柯酮-O-β-D-葡萄糖苷、決明柯酮-O-乙?；?葡萄糖苷、大黃素-8-O-(6′-O-丙二酰)-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚。

表1 不同加工何首烏中差異顯著化學(xué)成分的鑒定

(續(xù)表1)

2.6 差異化學(xué)成分的相對(duì)含量變化

15個(gè)共有差異成分中，3,5-二羥苯基-1-O-β-D-(6″-O-沒(méi)食子酰)-吡喃葡萄糖苷、決明柯酮-O-乙?；?葡萄糖苷和大黃素-8-O-(6′-O-丙二酰)-β-D-葡萄糖苷的相對(duì)含量在80 ℃烘干何首烏樣品中較高；沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、2-甲基-5-羧甲基-7-羥基對(duì)氧萘酮、大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷、決明柯酮-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的相對(duì)含量在曬干何首烏樣品中較高；原始車(chē)菊素B-7-3-O-沒(méi)食子酰和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的相對(duì)含量在40 ℃烘干何首烏樣品中較高；二苯乙烯苷的相對(duì)含量在50 ℃烘干何首烏樣品中較高；大黃素和大黃素甲醚在60 ℃烘干何首烏樣品中較高。

3 結(jié) 論

本文建立了UPLC-QTOF-MS結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)的不同加工何首烏化學(xué)成分的分析方法，找出差異顯著的化學(xué)成分及其變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同加工何首烏樣品間的化學(xué)組成存在顯著差異；初步篩選并鑒定出33種差異顯著的化學(xué)成分，其中共有差異化學(xué)成分15種，并呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。根據(jù)不同加工方法何首烏中的差異化學(xué)成分分析結(jié)果，結(jié)合當(dāng)?shù)氐膶?shí)際加工方法，建議何首烏產(chǎn)地初加工以曬干為宜。本研究結(jié)果為揭示加工對(duì)何首烏代謝產(chǎn)物的影響規(guī)律、優(yōu)選其適宜加工方法及探討何首烏藥材的品質(zhì)形成機(jī)制提供了依據(jù)。

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Analysis of Chemical Constituents in Polygoni Multifori Radix Processed by Different Methods Using UPLC-QTOF-MS

LUO Yi-yuan1,LIU Juan-xiu1,LIU Xun-hong1*,WANG Sheng-nan1,HUA Yu-jiao1,LAN Cai-wu2,XING Qing-qing1

(1.College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023，China;2.Research and Development, Guizhou Chang Hao Chinese Medicine Co.,Ltd.,Kaili 556000，China)

An ultra-performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometric(UPLC-QTOF-MS) method was developed for the analysis of the differences among chemical compositions in Polygoni Multifori Radix processed by different methods.The samples were extracted with methanol by ultrasonic at room temperature and centrifuged.The extracts were analyzed by UPLC-QTOF-MS.After peak matching,peak alignment and noise filtering of characteristic peak extraction,the obtained data were analyzed by principal component analysis(PCA) and partial least-squares discriminant analysis(PLS-DA).The results demonstrated that there were significant differences among the samples of Polygoni Multifori Radix with different processing methods.Accurate mass measurements and CID experiments as well as the software of database searching and literature component identification were applied to identify.The chemical compositions of Polygoni Multifori Radix by different processing methods were analyzed,and 33 constituents were identified.Among them,15 constituents were the common chemical composition presented in different changing laws.The research provided experimental data for revealing the laws of different processing methods on metabolites of Polygoni Multifori Radix.

Polygoni Multifori Radix;ultra-performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry(UPLC-QTOF-MS);processing methods;the difference of chemical composition

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.012

2016-07-23；

2016-08-29

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI13B04);江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(ysxk-2014)

*通訊作者：劉訓(xùn)紅，教授，研究方向：中藥鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)，Tel:025-85811511，E-mail:liuxunh1959@sohu.com

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)01-0073-07