Thr187磷酸化p27kip1與人乳腺癌MCF-7細胞化療敏感性的關系

郭志琴 呂青山 袁琳娜 王振 陸寧 柯萍 鄔萬新

Thr187磷酸化p27kip1與人乳腺癌MCF-7細胞化療敏感性的關系

郭志琴 呂青山 袁琳娜 王振 陸寧 柯萍 鄔萬新

目的探討人乳腺癌MCF-7細胞中第187位蘇氨酸（Thr187）磷酸化的細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白p27kip1（P-p27Thr187）與化療藥物敏感性的關系。方法人乳腺癌MCF-7細胞常規培養，采用MTT法測定其對5種常用化療藥物[表柔比星（EPI）、多西他賽（DOC）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、環磷酰胺（CTX）、順鉑（CDDP）]的敏感性；采用Western blot檢測經化療藥物作用后P-p27Thr187、p27kip1表達水平；采用免疫共沉淀方法檢測P-p27Thr187與S期激酶相關蛋白2（Skp2）相互結合情況。結果5種常用化療藥物對人乳腺癌MCF-7細胞均有抑制作用，5-Fu的抑制率隨濃度增加而增高，而其他4種化療藥物的抑制率開始隨濃度增加而增高，但達到理論最高藥物濃度（PPC）后降低（均P＜0．01）；在PPC下作用48h，抑制率從大到小的化療藥物依次為EPI、DOC、5-Fu、CTX、CDDP。Western blot結果顯示化療藥物作用48h后，P-p27Thr187表達水平明顯增加，以EPI、DOC增加最為明顯（均P＜0．01）；p27kip1表達水平明顯降低（均P＜0．01）。免疫共沉淀結果顯示，經EPI 0．25μg/ml、DOC 6．80μg/ml作用48h后，P-p27Thr187與Skp2結合明顯增加。結論P-p27 Thr187與人乳腺癌MCF-7細胞化療敏感性有關，可作為預測化療敏感性及選擇藥物的一項新指標。

乳腺癌p27kip1磷酸化化療敏感性

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來其發病率不斷上升，居女性惡性腫瘤病死率首位[1]?；熓悄壳爸委熑橄侔┑闹匾侄危[瘤細胞對化療藥物的耐藥性是影響療效與預后的重要因素。細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白（p27kip1）是重要的細胞周期負性調控因子，具有抑制細胞周期進程的作用，因此可作為一個潛在的化療敏感性的預測指標[2-3]。腫瘤細胞存在多種轉錄后調控機制來調節p27kip1表達，磷酸化是重要途徑之一[4]。人乳腺癌MCF-7細胞中第187位蘇氨酸（Thr187）的磷酸化可啟動細胞S期激酶相關蛋白2（Skp2）介導的p27kip1多聚泛素化以及隨后的蛋白酶體降解，影響細胞內p27kip1表達水平。為探討Thr187磷酸化p27kip1（P-p27Thr187）與人乳腺癌MCF-7細胞化療敏感性的關系，本文檢測并比較經不同化療藥物作用后人乳腺癌MCF-7細胞中p27kip1、P-p27Thr187表達水平，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑人乳腺癌細胞株MCF-7（嘉興市第一醫院中心實驗室保存）。兔抗人p27kip1多克隆抗體（C-19，美國Santa Cruz公司）；兔抗人P-p27Thr187多克隆抗體（71-7700，美國Zymed公司）；兔抗人Skp2多克隆抗體（H-435，美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG和β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國Sigma公司）；增強化學發光（ECL）試劑盒（美國Pierce公司）。含青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、10%胎牛血清的DMEM培養基（美國Gibco公司），MTT試劑盒（美國Sigma公司）。

1.2 化療藥物多西他賽（DOC，20mg/瓶或0.5ml/瓶，批號：131201，浙江萬晟藥業有限公司）；表柔比星（EPI，10mg/支或5ml/支，批號：131014，浙江海正藥業股份有限公司）；環磷酰胺（CTX，0.2g/瓶或20ml/瓶，批號：13120325，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）；5-氟尿嘧啶（5-Fu，0.25g/支或10ml/支，批號：FA131107，上海旭東海普藥業有限公司）和順鉑（CDDP，30mg/支或6ml/支，批號：130903，江蘇豪森藥業股份有限公司）。根據Limburg和Heckman公式[Cmax=D（mg）/5 000×2×103μg/ ml（血漿）]，確定藥物1次快速靜脈注射后理論最高藥物濃度（PPC）[5]；EPI、DOC、5-Fu、CTX、CDDP的PPC分別為0.25、6.80、10.00、5.00、2.50μg/ml。以上藥物用0.9%氯化鈉溶液稀釋成工作液。

1.3 方法

1.3.1 人乳腺癌細胞株MCF-7培養加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，細胞貼壁生長。2～3d后用2.5mg/ml胰酶消化，傳代1次。實驗取對數生長期細胞。

1.3.2 藥敏試驗96孔細胞培養板，分為空白組（無細胞培養基90μl加0.9%氯化鈉溶液10μl）、對照組（細胞懸液90μl加0.9%氯化鈉溶液10μl）和實驗組（細胞懸液90μl加化療藥物10μl，每組復種5孔）。置37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養48h，加入5mg/ml MTT0.9%氯化鈉溶液稀釋液，20μl/孔；繼續培養4h；培養結束后加入10%十二烷基硫酸鈉（酸化，含10%異丙醇）100μl/孔，振蕩，使結晶物充分溶解，終止反應。用酶聯免疫檢測儀測定各孔的吸光度（OD）值（測量波長570nm，參考波長630nm），取每組5孔OD平均值為最終結果。計算細胞生長抑制率（IR）=（OD對照-OD實驗）/（OD對照-OD空白）。并根據藥敏結果，篩選以下實驗的藥物作用濃度。

1.3.3 Western blot檢測用細胞裂解液提取總蛋白，用bradford法檢測所提取的蛋白濃度，取等量蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法將凝膠上蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉（含10%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液）2h。一抗（p27kip1，1∶800；P-p27Thr187，1∶1 000；β-actin，1∶2 000）室溫孵育1h，4℃孵育過夜。HRP耦聯的二抗（1∶1 000）室溫孵育2h，ECL顯色。應用Bio-Rad Quantity軟件分析測定其區帶的OD值，以β-actin為內參對照，用目的片段與βactin的比值表示蛋白表達水平。

1.3.4 免疫共沉淀法根據收集的細胞量，加入適量的細胞裂解液裂解細胞；在蛋白提取物中加入protein G瓊脂糖珠預澄清，取上清液，加入2μg抗P-p27Thr187抗體，4℃輪轉過夜；加入預冷的protein G瓊脂糖珠，4℃輪轉2h，沉淀重懸于20μl上樣緩沖液。采用Western blot檢測共沉淀蛋白質Skp2表達水平。實驗設正常兔IgG作陰性對照。

1.4 統計學處理應用SPSS 19.0統計軟件。計量資料用表示，兩樣本均數的比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.15 種化療藥物對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制率藥敏試驗結果顯示，5種化療藥物不同濃度分別作用48h后，對MCF-7細胞增殖均有明顯抑制作用。5-Fu的抑制率隨濃度增加而增高，而其他4種化療藥物的抑制率開始隨濃度增加而增高，但達到PPC后降低（均P＜0.01），見表1。在PPC下作用48h，對MCF-7細胞增殖的抑制率從大到小的化療藥物依次為EPI、DOC、5-Fu、CTX、CDDP。

2.2 化療藥物作用后P-p27Thr187、p27kip1表達水平5種化療藥物分別作用48h后，P-p27Thr187表達水平明顯增加，以EPI、DOC增加最為明顯（均P＜ 0.01）；p27kip1表達水平明顯降低（均P＜0.01），見表2和圖1。

2.3 P-p27Thr187與Skp2相互結合情況免疫共沉淀結果顯示，經EPI 0.25μg/ml、DOC 6.80μg/ml作用48h后，P-p27Thr187與Skp2結合明顯增加，見圖2。

表15 種化療藥物不同濃度作用48h后對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制率

表2 人乳腺癌MCF-7細胞中P-p27Thr187、p27kip1表達水平

圖1 Western blot檢測人乳腺癌MCF-7細胞中P-p27Thr187、p27kip1表達的電泳圖（對照組：細胞懸液90μl加0.9%氯化鈉溶液10μl；EPI：0.25μg/ml；DOC：6.80μg/ml；5-Fu：10.0μg/ml；CTX：5.0μg/ml；CDDP：2.5μg/ml，β-actin：內參對照）

圖2 免疫共沉淀法檢測人乳腺癌MCF-7細胞中P-p27Thr187與Skp2相互結合情況（a：用抗P-p27Thr187的抗體免疫沉淀P-p27Thr187；b：用抗Skp2的抗體免疫沉淀Skp2；IP：免疫沉淀；WB：Western blot；IgG：陰性對照）

3 討論

目前，化療是乳腺癌綜合治療的重要手段之一，可明顯提高患者生存率，但乳腺癌細胞普遍存在多藥耐藥現象。因此，研究乳腺癌細胞耐藥的產生機制是臨床治療乳腺癌急需解決的難題。已有研究證實腫瘤細胞的細胞周期處于失調控狀態，這種異常調控狀態與腫瘤細胞化療耐藥的產生有關。p27kip1是重要的細胞周期負性調控因子，其蛋白表達及活性改變與腫瘤的發生、發展及預后密切相關。Porter等[6]研究發現，在接受CTX、阿霉素輔助治療的激素受體陽性的乳腺癌患者中，p27kip1低表達與不良預后密切相關。亦有研究結果表明乳腺癌細胞中p27kip1高表達可導致癌細胞增殖率降低，對CTX不敏感；若下調p27kip1，敏感性逐漸恢復[7]。相關研究表明p27kip1具有抗凋亡的作用，它能阻滯靶向DNA的化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，從而使腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性[8]。上述研究中p27kip1對化療藥物敏感性的預測并不一致，可能與它們只檢測了蛋白表達水平而未考慮到磷酸化水平對其功能的影響所致。筆者前期研究發現P-p27Thr187在乳腺癌組織中高表達，陽性表達率達90%以上，且與乳腺癌患者淋巴結轉移、TNM分期相關；生存分析結果顯示P-p27Thr187高表達患者的總生存率、無瘤生存率均明顯低于低表達患者[9]。因此，本研究進一步從細胞水平研究P-p27Thr187與化療敏感性的關系。

乳腺癌體外藥敏試驗是個體化治療方案篩選的有效手段之一，對化療藥物的耐藥性、敏感性均有較高的準確率。MTT法因其簡便快捷、可評率高、觀察終點客觀等優點，而被廣泛應用于多種腫瘤的體外藥敏試驗中。本文采用MTT法對人乳腺癌MCF-7細胞進行腫瘤藥敏實驗，觀察經5種常用化療藥物作用后，P-p27Thr187表達水平對其化療敏感性的影響。藥敏試驗

結果顯示5種常用化療藥物對MCF-7細胞增殖均有抑制作用，除5-Fu的抑制率隨濃度增加而增高，其他4種化療藥物的抑制率隨濃度增加而增高，達到峰值后逐漸降低。此外，本研究還發現MCF-7細胞對化療藥物的敏感性不一，在同一PPC濃度下作用48h后的抑制率從大到小為EPI、DOC、5-Fu、CTX、CDDP，與姚清深等[10]研究結果類似，提示以蒽環類、紫杉醇類為主的化療仍是目前臨床首選的化療方案。Western blot檢測結果顯示經化療藥物處理后，P-p27Thr187表達水平明顯增高，以EPI、DOC增加最為明顯；p27kip1表達水平明顯降低。免疫共沉淀法檢測結果顯示經化療藥物作用后，P-p27Thr187與Skp2結合明顯增加。P-p27 Thr187可促進Skp2介導的p27kip1多聚泛素化以及蛋白酶體降解過程，從而降低p27kip1在細胞核中的表達水平，該過程可能在乳腺癌化療敏感性中發揮重要作用。綜上所述，P-p27 Thr187與人乳腺癌MCF-7細胞化療敏感性有關，可作為預測化療敏感性及選擇藥物的一項新指標，以指導腫瘤個體化化療方案的實施，提高乳腺癌的治療效果。

[1]Jemal A,Bray F,Center M M,et al．Global cancer statistics[J]．CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90．

[2]Ma Y,Yan M,Huang H,et al．Associations and prognostic significance of p27kip1,Jab1 and Skp2 in non-Hodgkin lymphoma[J]． Mol Clin Oncol,2016,5(4):357-364．

[3]Wang Y,Yu Y N,Song S,et al．JAB1 and phospho-Ser10 p27 expression profile determine human hepatocellular carcinoma prognosis[J]．J Cancer Res Clin Oncol,2014,140(6):969-978．

[4]Kazi A,Carie A,Blaskovich M A,et al．Blockade of protein geranylgeranylation inhibits Cdk2-dependent p27Kip1phosphorylation on Thr187 and accumulates p27kip1in the nucleus:implications for breast cancer therapy[J]．Mol Cell Biol,2009,29(8): 2254-2263．

[5]朱慕云,姜正華,呂元文,等．苦參堿聯合化療藥物對人肺癌細胞的生長抑制作用[J]．中西醫結合學報,2008,6(2):163-165．

[6]Porter P L,Barlow W E,Yeh I T,et al．p27kip1and cyclin E expression and breast cancer survival after treatment with adjuvant chemotherapy[J]．J Natl Cancer Inst,2006,98(23):1723-1731．

[7]Davidovich S,Ben-Izhak O,Shapira M,et al．Over-expression of Skp2 is associated with resistance to preoperative doxorubicin-based chemotherapy in primary breast cancer[J]．Breast Cancer Res,2008,10(4):R63．

[8]Cornelissen B,Kersemans V,McLarty K,et al．In vivo monitoring of intranuclear p27kip1protein expression in breast cancer cells during trastuzumab(Herceptin)therapy[J]．Nucl Med Biol,2009, 36(7):811-819．

[9]郭志琴,呂青山,張燕萍,等．乳腺癌SKP2及Thr187磷酸化p27kipl的表達及其預后意義[J]．中華病理學雜志,2013,42(3):197-198．

[10]姚清深,周林榮,秦軍,等．乳腺癌的腫瘤藥敏結果分析及臨床意義[J]．現代腫瘤醫學,2009,17(7):1275-1276．

Relationship of p27kip1Thr187 phosphorylation with chemosensitivity of breast cancer MCF-7 cells

ObjectiveTo investigate the relationship of p27kip1Thr187 phosphorylation(P-p27Thr187)with chemosensitivity of human breast cancer MCF-7 cells．MethodsCultured MCF-7 cells were treated with epirubicin(EPI),docetaxel(DOC), 5-fluorouracil(5-Fu),cyclophosphamide(CTX)and cisplatin(CDDP),the inhibitory rates were measured by MTT method．The expression of P-p27Thr187 and p27kip1was detected by Western blot．The conjugation of P-p27Thr187 and S-phase kinase-associated protein 2(Skp2)was detected by co-immunoprecipitation method．ResultsThe MTT assay showed that inhibitory effect of 5 chemotherapeutical agents on MCF-7 cells in a dose-dependent manner,and with an order of inhibitory effect as:EPI,DOC,5-Fu,CTX and CDDP．Western blot assay showed that after drugs treatment,the expression of P-p27Thr187 protein was significantly increased,while the expression of p27kip1was decreased．Co-immunoprecipitation revealed that the conjugation of P-p27Thr187 and Skp2 protein was increased significantly after the chemotherapy drugs treatment．ConclusionP-p27Thr187 protein might be related to the chemosensitivity in human breast cancer MCF-7 cells,and it could be used as a marker for clinical assessment of sensitivity to chemotherapy．

Breast cancerp27kip1PhosphorylationChemosensitivity

2016-07-29）

（本文編輯：陳丹）

浙江省醫學重點學科建設計劃項目（GJJX-010-001）；嘉興市科技計劃項目（2013AY21042-3）；嘉興市醫學重點支撐學科建設計劃項目（04-Z-01）；嘉興市第一醫院“啟明星”計劃項目（2013QMX003）

314000嘉興市第一醫院病理科（郭志琴、袁琳娜、王振、陸寧、柯萍、鄔萬新），檢驗科（呂青山）

郭志琴，E-mail：guozhq@foxmail.com.