丙泊酚對在體小鼠小腦皮層浦肯野細胞自發性活動的影響

呂 冰 邱德來 初春平 金 日 金文哲

(延邊大學附屬醫院疼痛科，吉林 延吉 133000)

丙泊酚對在體小鼠小腦皮層浦肯野細胞自發性活動的影響

呂 冰 邱德來1初春平1金 日2金文哲

(延邊大學附屬醫院疼痛科，吉林 延吉 133000)

目的 探討丙泊酚對在體小鼠小腦皮層浦肯野細胞自發性單純性放電活動、自發性復雜峰電位放電特性的影響。方法 選用6～8周齡ICR小鼠6只，腹腔注射烏拉坦麻醉，在小腦CrusⅡ小葉行開顱手術，開孔直徑為1.0～1.5 mm，去除硬腦膜后，用蠕動泵在腦表面持續灌流含氧的人工腦脊液，浦肯野細胞貼附式記錄使用Multi clamp700B膜片鉗放大器，通過D/A轉換器1440和Clampfit 10.3軟件獲取浦肯野細胞自發性活動數據。待自發性活動記錄穩定后，給予丙泊酚，觀察其對浦肯野細胞自發性單純峰電位(SS)和復雜峰電位(CS)活動的影響。結果 腦表面給予丙泊酚劑量依存地抑制小鼠小腦浦肯野細胞自發性SS放電活動，其半數抑制濃度為143 μmol/L，當濃度為500 μmol/L時自發性SS放電完全抑制，然而，丙泊酚對自發性復雜峰電位放電頻率和波形特征無顯著影響。結論 在體條件下，腦表面灌流丙泊酚顯著抑制浦肯野細胞自發性SS放電活動。

丙泊酚；浦肯野細胞；小腦皮層；細胞貼附式記錄

丙泊酚由于起效快、清除迅速和不良反應少等優點被廣泛應用于全麻誘導與維持、重癥監護室(ICU)患者鎮靜、無痛胃腸鏡及無痛人流手術中。離體和在體實驗均表明丙泊酚可通過活化γ-氨基丁酸(GABA)A型受體(GABAA)和甘氨酸受體對脊髓、海馬和下丘腦神經元的活動產生抑制作用；然而，丙泊酚對在體動物小腦皮層神經元活動的影響報道極少。本實驗擬應用細胞吸附式技術手段，在活體動物上觀察丙泊酚的攝入對小鼠小腦皮層浦肯野細胞(PC)自發性活動的影響。

1 材料與方法

1.1 動物選擇和主要試劑 選用6～8周齡健康雄性ICR小鼠6只，體重28～32 g，由延邊大學實驗動物中心提供。丙泊酚(批號：16IF1533)。人工腦脊液(ACSF)由以下成分組成(mmol/L):125 NaCl，3 KCl，1 MgSO4,2 CaCl2，1 NaH2PO4，25 NaHCO3，10 D-glucose。ACSF的滲透壓為290～300 MOSM，pH 7.2～7.4。

1.2 主要儀器 美國產Multi clamp700B膜片鉗放大器、1440AD/DA轉換器、日本Nikon公司產膜片鉗專用顯微鏡、美國Sutter公司生產的電動微操縱器(MP 385和MP 285)、微量噴射器(Picospritzer Ⅲ，美國)、德國萊卡公司生產的DM5500B顯微鏡、法國產Minipuls3蠕動泵、日本精密牙科鉆及電極拉制儀等。

1.3 動物模型的制備 小鼠腹腔注射烏拉坦麻醉后固定在自制的腦定位儀上，通過加熱墊使麻醉小鼠的體溫穩定在(37.0±0.2)℃。在小腦手術部位周圍制作一個防漏水記錄槽后實施開顱手術〔直徑(1.0±1.5)mm〕，除去硬腦膜后暴露出小腦皮層CrusⅡ部位進行電生理記錄。手術暴露腦表面部位用蠕動泵持續灌流給予人工腦脊液(ACSF)，待自發性活動記錄穩定后，給予丙泊酚。

1.4 PC放電記錄 使用自動拉制儀將細玻璃管拉制成記錄電極，填充20～30 μl ACSF，將記錄電極安裝于電動微操作器上，通過顯微鏡觀測電極移動，在顯微鏡下確定記錄部位后，將記錄電極準確置于記錄區域。PC貼附式記錄使用Multi clamp700B放大器，通過D/A轉換器1440和Clampfit10.3軟件獲取PC自發性活動數據。記錄電極內填充ACSF，填充后阻抗為3～5 MΩ。在細胞貼附式記錄條件下，PC是通過其獨特的單純和復雜放電模式認定的。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行配對t檢驗或單因素方差分析。

2 結 果

2.1 高濃度丙泊酚對小腦PCs自發性簡單峰電位和復雜峰電位放電率的影響 在細胞貼附式記錄模式下，通過自發性規律簡單峰電位(SS)和不規律復雜峰電位(CS)的放電特征，共有22個神經元被認定為PC。小腦表面給予丙泊酚(500 μmol/L)完全抑制自發性單純性放電，PC自發性SS放電頻率較給藥前相比降低了99.5%，但對自發性復雜峰電位放電頻率無顯著影響。見圖1。

A，給予ACSF(上面)和500 μmol/L丙泊酚(下面)記錄的PCs的SS；1)表示復雜峰電位；B，500 μmol/L丙泊酚誘導的PCs單純性放電頻率變化的時間過程；C，500 μmol/L丙泊酚誘發PCs單純性放電頻率變化的時間過程統計圖圖1 高濃度丙泊酚對小腦PCs自發性簡單峰電位和復雜峰電位放電率的影響

2.2 丙泊酚對PCs自發性SS抑制作用的劑量依存關系丙泊酚對小鼠小腦PCs自發性SS活動的抑制具有劑量依存性，可引起PCs自發性SS放電顯著抑制的最小濃度為10 μmol/L，其抑制程度可達3%左右；半數有效抑制濃度為143 μmol/L，500 μmol/L的丙泊酚已經達到最大抑制濃度。見圖2。

2.3 丙泊酚對PCs自發性復雜峰電位特征的影響 雖然丙泊酚對PC自發性SS放電明顯抑制，但不影響CS自發性活動。進一步分析發現，在丙泊酚存在條件下CS自發性活動頻率為0.53 Hz，與給藥前(0.46 Hz)相比無顯著差異(P>0.05)。而CS放電小穗平均數量為3.3 個，與給藥前(3.3 個)比較也無顯著差異(P>0.05)。見圖3。

圖2 丙泊酚對PCs自發性SS抑制作用的劑量依存關系

圖3 丙泊酚對PCs自發性復雜峰電位特征的影響

3 討 論

小腦皮層主要通過苔狀纖維(MF)和爬行纖維(CF)傳入外部信息，參與精細運動調節和運動學習。一般認為，經MF傳入的感覺信息通過顆粒細胞的軸突-平行纖維途徑間接地興奮PC，表現為簡單峰電位(simple spike)，而經CF傳入的感覺信息可興奮PC，表現為復雜峰電位(complex spikes)〔1〕。MLI是PC的抑制性中間神經元，分為籃狀細胞(BC)和星狀細胞(SC)。BC的軸突末梢包裹在PC的胞體和軸突起始段，其興奮可使PC產生迅速而強烈的環胞體抑制，直接影響PC峰電位的輸出；而SC的軸突選擇性地與PC樹突形成抑制性突觸聯系，SC興奮可對PC樹突產生抑制，分流平行纖維的興奮性傳入，平衡PC樹突的興奮性〔2〕。Chu等〔3～5〕發現感覺刺激不能興奮PC，反而興奮MLIs，導致 PC產生抑制、單純性放電暫停。

靜脈麻醉藥對神經系統功能影響機制的研究方法分為離體腦片記錄和在體記錄兩大類。腦片標本保持了部分在體情況下的神經通路，并且易于施加藥物和觀察藥物的直接作用，但是腦片的制備過程比較復雜，且不可避免地損傷復雜的神經網絡，因此腦片僅是對生理條件的近似模擬。在體電生理記錄的優勢在于能真實地反映生理狀態下神經突觸傳遞的情況，能夠在整體條件下觀察神經突觸活動的變化，利于從宏觀角度研究和探討靜脈麻醉藥物的作用機理。

Jin等〔6〕在體研究小鼠小腦表面給予丙泊酚 (10～1 000 μmol/L)劑量-依存性地抑制PCs SS頻率，半數有效濃度為144.5 μmol/L。大劑量完全抑制PCs自發性SS，但對CS放電頻率和波形特征無顯著影響。最近研究發現，小鼠在體小腦表面灌流丙泊酚(10～1 000 μmol/L)顯著降低感覺刺激誘發抑制GABA能突觸傳遞反應的振幅和波形下面積，但明顯增加該反應波形的上升時間與延遲時間。

腦表面灌流丙泊酚可顯著增加感覺刺激誘發興奮性反應的振幅和波形下面積，同時也增加該反應的上升時間和延遲時間。丙泊酚對小腦皮層感覺信息傳遞的影響可以被GABAA受體阻斷劑阻斷。上述結果表明丙泊酚通過調控成年小鼠GABAA受體活化影響感覺信息在小腦皮層分子層神經元網絡中傳遞的動力學特征〔7〕。另有研究表明，丙泊酚通過活化N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)受體顯著增強小鼠面部感覺刺激誘發的顆粒細胞層場電位反應，但丙泊酚對顆粒細胞層感覺刺激誘發場電位的增強作用與GABAA受體活化無關，進一步揭示了丙泊酚導致面部感覺刺激誘發小腦分子層和PC平行纖維興奮性傳入的增強機制〔8〕。本實驗結果表明，在體條件下，腦表面灌流丙泊酚顯著抑制浦肯野細胞自發性SS放電活動。在以后的研究中，有必要進一步深入研究丙泊酚對小腦神經元環路、感覺信息傳遞及突觸可塑性的影響機制。

1 韓濟生.神經科學〔M〕.第3版.北京：北京大學醫學出版社,2008:796-818.

2 Santamaria F，Tripp PG，Bower JM.Feedforward inhibition controls the spread of granule cell-induced Purkinje cell activity in the cerebellar cortex〔J〕.J Neurophysiol，2007;97(1)：248-63.

3 Chu CP，Bing YH，Qiu DL.Sensory stimulus evokes inhibition rather than excitation in cerebellar Purkinje cells in vivo in mice〔J〕.Neurosci Lett,2011;487(2):182-6.

4 Chu CP，Bing YH，Liu QR，etal.Synaptic responses evoked by tactile stimuli in purkinje cells in mouse cerebellar cortex crus Ⅱ in vivo〔J〕.PLoS One，2011;6(7)：e22752.

5 Chu CP，Bing YH，Liu H，etal.Roles of molecular layer interneurons in sensory information processing in mouse cerebellar cortex crus Ⅱ〔J〕.PLoS One，2012;7(5)：e37031.

6 Jin R，Liu H，Jin WZ，etal.Propofol depresses cerebellar Purkinje cell activity via activation of GABAA and glycine receptors in vivo in mice〔J〕.Eur J Pharmacol，2015;764(1):87-93.

7 Jin WZ，Shi JD，Lin H，etal.Effects of propofol on the dynamic properties of sensory information processing in the mouse cerebellar cortical molecular layer in vivo〔J〕.Pharmacology，2015;96(5-6):271-7.

8 Jin WZ，Liu H，Wan P，etal.Propofol enhances facial stimulation-evoked responses in the cerebellar granule cell layer via activation of NMDA receptor in mice in vivo 〔J〕.Eur J Pharmacol，2016;788(1):37-44.

〔2015-12-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學基金(81560194)；吉林省教育廳“十三五”科學技術研究項目(吉教科合字2016第267號)；延邊大學科技發展計劃項目(延大科合字2014第38號)

金 日(1975-)，男，博士，碩士生導師，主要從事運動損傷和關節外科的診療。 金文哲(1971-)，男，博士，碩士生導師，主要從事靜脈麻醉藥影響小腦皮層功能方面的研究。

呂 冰(1991-)，男，碩士，主要從事神經病理性疼痛電生理機制的研究。

R74

A

1005-9202(2017)01-0017-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.007

1 吉林省細胞功能與藥理重點實驗室 延邊大學醫學部生理學與病理生理學教研室 2 延邊大學附屬醫院骨科