miR-26b在卵巢癌組織中的表達(dá)與功能

陳 誠(chéng) 游雪云 付子毅

(撫州市婦幼保健院，江西 撫州 344000)

miR-26b在卵巢癌組織中的表達(dá)與功能

陳 誠(chéng) 游雪云1付子毅2

(撫州市婦幼保健院，江西 撫州 344000)

目的 探討microRNA-26b(miR-26b)在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，并探討其對(duì)卵巢癌細(xì)胞株HO8910惡性行為的影響。方法 采用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)72例卵巢癌患者經(jīng)手術(shù)切除的上皮性卵巢癌組織標(biāo)本(卵巢癌組)中的miR-26b水平，同時(shí)選取26例正常卵巢上皮組織(正常組)和45例良性卵巢上皮囊腫組織(良性組)作對(duì)照，分析miR-26b表達(dá)與臨床病理參數(shù)(年齡、臨床分期、分化程度、組織類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)的關(guān)系。將化學(xué)合成miR-26b前體分子 mimics 和無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株HO8910，采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染 24、48、72、96 h后的細(xì)胞增殖情況，采用流式細(xì)胞儀PI/Annexin V-FITC雙染法及PI單染法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期情況。結(jié)果 卵巢癌組的miR-26b水平均低于正常組和良性組(P<0.05)，且其表達(dá)與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P<0.05)。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-26b mimics)的增殖抑制率和凋亡率均升高，且細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞比例升高而S期細(xì)胞比例降低(P<0.05)。結(jié)論 在卵巢癌細(xì)胞中上調(diào)miR-26b表達(dá)可抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期組織，在卵巢癌防治中有一定價(jià)值。

卵巢癌；miR-26b

卵巢癌是一種惡性程度較高的婦科腫瘤，發(fā)病隱匿且缺乏有效篩查手段，確診時(shí)多為晚期，無(wú)法行手術(shù)治療，而常規(guī)治療手段效果不理想〔1〕。深入研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和致病基因是目前的當(dāng)務(wù)之急〔2〕。microRNA是一種可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的保守非編碼RNA,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化關(guān)系密切。microRNA-26b(miR-26b)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且在肝癌、胃癌和乳腺癌組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)〔3～5〕，但目前在卵巢癌中的功能尚不清楚。本研究擬首先在卵巢癌組織中觀察miR-26b的表達(dá)，然后通過(guò)轉(zhuǎn)染手段觀察過(guò)表達(dá)其水平對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑 人卵巢癌細(xì)胞株HO8910購(gòu)自上海中科院生化細(xì)胞所，置于含10%胎牛血清的RPMI1640中常規(guī)條件培養(yǎng)。RNA抽提試劑盒Trizol、脂質(zhì)體試劑Lipofectamine 2000TM購(gòu)自Invitrogen公司， SYBR qPCR Mix及ROX校正染料購(gòu)自Fermentas 公司，miR-26b 前體分子 mimics(5′-UGGAUAGGACUUAAUGAACUU-3′)和無(wú)關(guān)序列(5′-GGCUGACAGCCUUAUCAG-3′)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司，膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 組織樣本 收集2013年1月至2015年12月江西省婦幼保健院病理科存檔的72例卵巢癌患者手術(shù)切除的上皮性卵巢癌組織標(biāo)本(卵巢癌組)，均經(jīng)病理確診且取樣前未行放化療，年齡31～64歲，中位年齡52.5歲，≤50歲29例，>50歲43例；臨床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期19例，Ⅲ期21例，Ⅳ期17例；組織學(xué)類型：漿液性36例，黏液性16例，內(nèi)膜樣13例，透明細(xì)胞7例；分化程度：低分化28例，中分化25例，高分化19例；47例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。選取26例正常卵巢上皮組織(正常組)和45例良性卵巢上皮囊腫組織(良性組)作對(duì)照，其中正常組取材于子宮肌瘤或子宮腺肌癥等手術(shù)同時(shí)行附件切除術(shù)的卵巢，年齡范圍30～63歲，中位年齡53.0歲；良性組的年齡范圍33～68歲，中位年齡55.0歲。3組年齡均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具可比性。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR) 將液氮凍存的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，采用TRIzol法提取總RNA，選取符合擴(kuò)增要求的RNA(OD260/OD280介于1.8～2.0)。

每份RNA樣品均取2 μg在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總體系為20 μl，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，后按95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，其中miR-26b上游：5′-CAAAGGTCCATAGCAAGGGT-3′； 下游：5′-GCGACCTTGTCATGGTTTATAG-3′；內(nèi)參U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； 下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算卵巢癌組和良性組相對(duì)于正常組的miR-26b表達(dá)量。分析miR-26b表達(dá)與卵巢癌臨床病理參數(shù)(年齡、臨床分期、分化程度、組織類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)的關(guān)系。

1.4 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HO8910細(xì)胞分為對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組和過(guò)表達(dá)組，對(duì)照組不行轉(zhuǎn)染處理；過(guò)表達(dá)組通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000包裹miR-26b mimics后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HO8910細(xì)胞；空轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列，轉(zhuǎn)染24 h后采用qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞的miR-26b以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.5 細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HO8910細(xì)胞，以1×104細(xì)胞/孔接種于無(wú)菌96孔培養(yǎng)板，分組同上，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別取轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用微量移液器向每孔各加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h后吸取孔內(nèi)上清，每孔加入DMSO 150 μl，搖床上震蕩10 min后在ELX800型自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)各組吸光值(A)，根據(jù)公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的增殖抑制率：增殖抑制率= (1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100。

1.6 流式細(xì)胞儀PI/Annexin V雙染法 收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，按1×105個(gè)/ml的密度接種培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染24、48 h后取100 μl細(xì)胞置于流式管中，加入Annexin V-FITC 10 μl和PI 5 μl溶液，避光孵育15 min后FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞周期檢測(cè) 收集各組轉(zhuǎn)染96 h的HO8910細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗后用預(yù)冷乙醇固定2 h以上，PBS清洗后加入RNase A處理30 min，加入20 g/ml PI溶液，避光反應(yīng)30 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各周期細(xì)胞分布。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件。計(jì)量資料兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-26b在卵巢癌組織中的表達(dá)情況 卵巢癌組miR-26b水平(0.247±0.011)低于正常組(1.014±0.009)和良性組(1.102±0.026)(P<0.05)；正常組和良性組miR-26b水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 miR-26b水平與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 卵巢癌組織中，miR-26b水平與年齡(≤50歲組：0.254±0.019，>50歲組0.242±0.023)及組織學(xué)類型(漿液性0.249±0.022，其他：0.245±0.019)均無(wú)關(guān)(P>0.05)，但與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P<0.05)，其中Ⅲ+Ⅳ期(0.154±0.017)、低分化(0.133±2.021)及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0.186±0.012)的miR-26b水平均低于相應(yīng)項(xiàng)(Ⅰ+Ⅱ期：0.351±0.045；高+中分化：0.288±0.027；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.361±0.031)(P<0.05)。

2.3 HO8910細(xì)胞過(guò)表達(dá)后的miR-26b水平 過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染96 h后的miR-26b水平(6.114±0.472)高于對(duì)照組(1.057±0.024)(P<0.05)，提示在HO8910細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)miR-26b；空轉(zhuǎn)染組的miR-26b水平為(0.991±0.032)，與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-26b對(duì)HO8910細(xì)胞增殖水平的影響 過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染24～96 h的增殖抑制率均高于其余兩組(P<0.05)，其中96 h細(xì)胞基本死亡；其余兩組增殖抑制率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.5 過(guò)表達(dá)miR-26b對(duì)HO8910細(xì)胞凋亡水平的影響 對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組的凋亡率分別為(5.54±0.39)%和(6.13±0.57)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；過(guò)表達(dá)組的凋亡率為(33.29±2.64)%，高于其余兩組(P<0.05)。

2.6 過(guò)表達(dá)miR-26b對(duì)HO8910細(xì)胞周期水平的影響 與其余兩組相比，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞比例升高而S期細(xì)胞比例降低(P<0.05)；對(duì)照組和空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

組別24h48h72h96h對(duì)照組0000空轉(zhuǎn)染組0.75±0.091.12±0.130.98±0.200.85±0.17過(guò)表達(dá)組15.49±1.571)2)42.56±2.821)2)72.19±3.651)2)96.19±3.111)2)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與空轉(zhuǎn)染組比較:2)P<0.05；下表同

組別G0/G1SG2/M對(duì)照組45.61±2.7537.28±2.6219.13±1.35空轉(zhuǎn)染組47.33±2.9236.95±3.1920.48±1.76過(guò)表達(dá)組71.42±3.401)2)18.19±1.781)2)21.67±2.121)2)

3 討 論

miRNAs在腫瘤調(diào)控中主要以癌基因或抑癌基因的形式發(fā)揮作用，但miRNA對(duì)腫瘤的調(diào)控模式研究仍處于初步階段〔6,7〕。針對(duì)卵巢癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的miRNA進(jìn)行研究有重要臨床價(jià)值。miR-26b在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，且在不同腫瘤中扮演著癌基因或抑癌基因的角色〔8,9〕，提示miR-26b具有腫瘤特異性。本研究提示miR-26b在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-26b水平與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，其中腫瘤惡性程度越高時(shí)(如臨床分期越晚、分化程度越低)miR-26b水平越低，以上結(jié)果表明miR-26b在卵巢癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，推測(cè)miR-26b水平降低可能與其表達(dá)受抑制有關(guān)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-26b的功能，本研究選取常見(jiàn)的HO8910細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)染前體mimics，在轉(zhuǎn)染24 h后即可發(fā)現(xiàn)miR-26b水平大幅升高，表明HO8910細(xì)胞成功過(guò)表達(dá)miR-26b，具有較好的方法學(xué)基礎(chǔ)。過(guò)表達(dá)miR-26b后HO8910細(xì)胞的增殖抑制率升高，表明過(guò)表達(dá)miR-26b可抑制HO8910細(xì)胞增殖，此外過(guò)表達(dá)miR-26b可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，更好地說(shuō)明miR-26b具有抑癌基因的效果。miR-26b可抑制卵巢癌細(xì)胞的惡性行為可能與其調(diào)控的靶基因有關(guān)，如馬德亮等〔10〕的研究發(fā)現(xiàn)miR-26b可靶向抑制Wnt信號(hào)通路中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的表達(dá)，負(fù)性參與乳腺癌細(xì)胞的干性調(diào)節(jié)，而葉勁軍等〔11〕發(fā)現(xiàn)miR-26b能與MDM2 3′UTR 特異結(jié)合，并調(diào)控P53/MDM2通路影響胃癌細(xì)胞的增殖及凋亡。

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〔2016-04-15修回〕

(編輯 徐 杰)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81302304)

陳 誠(chéng)(1975-)，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)研究。

R739

A

1005-9202(2017)01-0015-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.006

1 江西省婦幼保健院 2 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)研究中心