CTRP9基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

梁麗麗 蔡夢云 周萌媛 陳 琳 劉新光，2 熊興東，2

(廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所，廣東 東莞 523808)

CTRP9基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

梁麗麗1蔡夢云1周萌媛1陳 琳1劉新光1，2熊興東1，2

(廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所，廣東 東莞 523808)

目的 探討廣東地區(qū)漢族人群CTRP9基因多態(tài)性與冠心病遺傳易感的相關(guān)性。方法 入選冠心病患者548例和對照個(gè)體862例，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(PCR-LDR)技術(shù)檢測CTRP9基因的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs6583、rs9553238的基因型，并采用Logistic回歸分析兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和冠心病的易感性。結(jié)果 rs6583和rs9553238的等位基因、基因型頻率在廣東地區(qū)漢族人群的冠心病組和對照組分布中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，構(gòu)建的顯性模型、隱性模型、加性模型在冠心病組和對照組中也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；CTRP9基因單體型(rs6583-rs9553238)在這兩組中仍未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 CTRP9基因rs6583和rs9553238多態(tài)位點(diǎn)與廣東地區(qū)漢族人群的冠心病遺傳易感無顯著相關(guān)性。

CTRP9；單核苷酸多態(tài)性；冠心??；遺傳易感性

冠心病的發(fā)生和發(fā)展不僅與吸煙、飲酒等外在環(huán)境因素有關(guān)，也與個(gè)體內(nèi)在的遺傳背景差異密切相關(guān)〔1，2〕。單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的變異與冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)〔3～5〕。C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9(CTRP9)是由Wong等〔6〕首先發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子，屬于CTRP家族成員。與抗炎、抗凋亡、抗動(dòng)脈硬化的脂聯(lián)素結(jié)構(gòu)高度同源，也具有相似的調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)的功能，因此與動(dòng)脈硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔7～10〕。人CTRP9基因定位于13號染色體，含有4個(gè)外顯子〔6，11〕。rs6583，rs9553238是CTRP9基因的兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，最小等位基因頻率(MAF)>5%，且均位于CTRP9基因的5′ UTR，提示rs6583和rs9553238的變異可能會影響CTRP9基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。探討廣東地區(qū)漢族人群CTRP9基因rs6583，rs9553238多態(tài)位點(diǎn)與冠心病易感的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 548例冠心病患者和862例對照個(gè)體選自2011年3月至2015年5月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和佛山市第一人民醫(yī)院。病例組入選標(biāo)準(zhǔn)：符合國際心臟病學(xué)會和 WHO 臨床命名的《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》，即冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果顯示在主要冠狀動(dòng)脈血管中，至少存在1條血管內(nèi)徑狹窄超過50%。對照組經(jīng)詢問病史、調(diào)查問卷、心臟核素掃描、CT 冠狀動(dòng)脈成像或冠狀動(dòng)脈造影等檢查排除冠心病的個(gè)體。每一例納入對象均無任何血緣關(guān)系，排除心肌病、肺心病、風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病、充血性心力衰竭、周圍血管性疾病、肝腎疾病及其他惡性腫瘤患者。詳細(xì)登記病例資料，記錄其年齡、性別、體重、身高、民族、籍貫、是否吸煙、是否喝酒，是否患有高血壓、糖尿病、高脂血癥，是否有冠心病家族史等的資料。高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)，收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg或者目前正在服用降壓藥〔12〕。糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，空腹血糖≥7.0 mmol/L，或者目前正在服用降糖藥〔13〕。高脂血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，甘油三酯(TG)>1.70 mmol/L，總膽固醇(TC)>5.72 mmol/L，或者目前正在服用降脂藥〔14〕。標(biāo)本收集過程中均告知樣本收集方法和研究意義。本研究通過廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和佛山市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)耗材與設(shè)備 TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，JY600+電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，PRISM 3730測序儀(ABI公司)，F(xiàn)R-200A全自動(dòng)紫外與可見分析裝置(上海復(fù)日科技有限公司)，特異性PCR引物合成(上海瀚宇生物工程有限公司)，LDR探針合成(Life technologies公司)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA抽提 采集外周靜脈全血2 ml于EDTA-K2抗凝管中，按照TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒的操作說明，提取外周全血基因組DNA，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因分型 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(PCR-LDR)檢測CTRP9(rs6583，rs9553238)多態(tài)的基因分型。PCR擴(kuò)增目的片段，rs6583的上游引物為5′-CAGAACGAGTTTGGCAAATG-3′，下游引物為5′-TTGCTGTTGACAGCCAAAGT-3′，產(chǎn)物長度為177 bp。rs9553238的上游引物為5′-TGAGCTGGGAGGTTGAGACT-3′，下游引物為5′-GGTGTTCTTTGAGTCAGGGTCT-3′，產(chǎn)物長度為208 bp。PCR反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，53℃退火1 min 30 s，65℃延伸30 s，共進(jìn)行35次循環(huán)，最后65℃延伸10 min。3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，通過觀察PCR產(chǎn)物的效果，確定其作為模板在LDR反應(yīng)中加入的量。LDR反應(yīng)體系為10 μl；反應(yīng)程序：95℃ 2 min，94℃變性15 s，50℃反應(yīng)25 s，共進(jìn)行40次循環(huán)。產(chǎn)物用ABI PRISM 3730測序，運(yùn)用GeneMapper 4.0軟件對所得結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件。采用goodness-of-fitχ2進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)基因型的Hardy-Weinberg平衡檢測，t檢驗(yàn)分析連續(xù)性變量資料，χ2檢驗(yàn)分析分類變量資料，Logistic回歸計(jì)算比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)，評價(jià)等位基因和基因型與冠心病發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)度，并利用心血管疾病危險(xiǎn)因素進(jìn)行校正，SHEsis軟件(http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析單體型頻率(頻率小于0.03的不納入統(tǒng)計(jì))。

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組與對照組一般臨床資料比較 年齡、總膽固醇(TC)在冠心病組和對照組中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；但冠心病組的吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥的人數(shù)明顯多于對照組，收縮壓、舒張壓、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著高于對照組(均P<0.01)。見表1。

2.2 CTRP9基因的多態(tài)位點(diǎn)rs6583、rs9553238基因型的判別 CTRP9(rs6583、rs9553238)多態(tài)位點(diǎn)的LDR分型結(jié)果，純合子的LDR探針擴(kuò)增測序圖譜為單峰，雜合子的LDR探針擴(kuò)增測序圖譜為雙峰。rs6583對應(yīng)的LDR片段長度分別為162 bp和164 bp，rs9553238對應(yīng)的LDR片段長度分別為174 bp和176 bp。見圖1。

圖1 CTRP9基因rs6583、rs9553238多態(tài)位點(diǎn)的LDR分型圖

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) CTRP9(rs6583、rs9553238)在對照組中的P值分別為0.748、0.092，均符合Hardy-Weinberg平衡，表明本研究能夠反映rs6583和rs9553238在整體人群基因型的分布情況(P>0.05)。

2.4 CTRP9基因的多態(tài)位點(diǎn)rs6583、rs9553238與冠心病遺傳易感的關(guān)聯(lián)分析 Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)rs6583、rs9553238的等位基因和基因型與冠心病的遺傳易感無相關(guān)性(P>0.05)。此外，構(gòu)建顯性模型、隱性模型、加性模型分析rs6583、rs9553238與冠心病遺傳易感的相關(guān)性。rs6583的結(jié)果顯示，顯性模型(OR=1.12，95%CI=0.87～1.45，P=0.378)，隱性模型(OR=1.09，95%CI=0.68～1.74，P=0.730)，加性模型(OR=1.06，95%CI=0.86～1.29，P=0.588)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。rs9553238的結(jié)果顯示，顯性模型(OR=1.31，95%CI=0.73～2.37，P=0.367)，隱性模型(OR=1.06，95%CI=0.82～1.38，P=0.669)，加性模型(OR=1.00，95%CI=0.81～1.24，P=0.989)仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 CTRP9基因rs6583、rs9553238多態(tài)位點(diǎn)與冠心病遺傳易感的關(guān)聯(lián)分析〔n(%)〕

多態(tài)位點(diǎn)對照組(n=862)冠心病組(n=548)OR(95%CI)P值rs6583等位基因T1212(70.3)759(69.3)1.00C512(29.7)337(30.7)1.05(0.89～1.24)0.549基因型TT428(49.7)254(46.4)1.00CT356(41.3)251(45.8)1.15(0.88～1.51)0.305CC78(9.0)43(7.8)0.99(0.61～1.60)0.951加性模型1.06(0.86～1.29)0.588顯性模型TT428(49.7)254(46.4)1.00CT+CC434(50.3)294(53.6)1.12(0.87～1.45)0.378隱性模型CC78(9.0)43(7.8)1.00CT+TT784(91.0)505(92.2)1.09(0.68～1.74)0.730rs9553238等位基因T395(23.0)248(22.6)1.00C1329(77.0)848(77.4)1.02(0.85～1.21)0.863基因型TT54(6.3)26(4.7)1.00CT287(33.3)196(35.8)1.40(0.76～2.58)0.286CC521(60.4)326(59.5)1.26(0.70～2.30)0.442加性模型1.00(0.81～1.24)0.989顯性模型TT54(6.3)26(4.7)1.00CT+CC808(93.7)522(95.3)1.31(0.73～2.37)0.367隱性模型CC521(60.4)326(59.5)1.00CT+TT341(39.6)222(40.5)1.06(0.82～1.38)0.669

2.5 單體型的構(gòu)建及其與冠心病遺傳易感的關(guān)系 rs6583和rs9553238構(gòu)建的單體型分別為CC、CT、TC、TT。結(jié)果顯示，rs6583、rs9553238構(gòu)建的單體型與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表4 CTRP9基因單體型與冠心病遺傳易感的關(guān)聯(lián)分析〔n(%)〕

單體型對照組(n=862)冠心病組(n=548)OR(95%CI)P值CC168.85(9.8)126.71(11.6)1.20(0.94～1.54)0.135CT343.15(19.9)210.29(19.2)0.96(0.79～1.16)0.640TC1160.15(67.3)721.29(65.8)0.94(0.80～1.10)0.415TT51.85(3.0)37.71(3.4)1.15(0.75～1.76)0.523

3 討 論

冠心病是受到環(huán)境因素和遺傳因素互相作用的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜的多基因疾病〔15，16〕。除了高血壓、高血糖、高血脂等冠心病危險(xiǎn)因素外，基因多態(tài)性對冠心病發(fā)病所起的作用開始受到重視。

CTRP9是一種分泌型糖蛋白，主要在脂肪組織中表達(dá)，是CTRP家族中與脂聯(lián)素結(jié)構(gòu)最接近的分子，能與脂聯(lián)素形成異源三聚體。越來越多研究表明，CTRP9在心血管疾病中發(fā)揮著重要作用。CTRP9可誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性的血管舒張作用；CTRP9還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化形成毛細(xì)血管樣管狀結(jié)構(gòu)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞〔17〕。血管平滑肌細(xì)胞通過增殖和向內(nèi)膜遷移可以促進(jìn)動(dòng)脈硬化的發(fā)生，而CTRP9可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和新生內(nèi)膜的形成，阻止血管重構(gòu)的病理進(jìn)程〔18〕。在糖尿病小鼠的血清中，CTRP9濃度與血小板聚集呈負(fù)相關(guān)，體外補(bǔ)充CTRP9可有效抑制血小板的活性，減少小鼠血管內(nèi)血栓的形成〔19〕。在缺血再灌注小鼠模型中，CTRP9可減少小鼠心肌梗死的面積和心肌細(xì)胞的凋亡損傷〔20〕。已有的研究證實(shí)，冠心病是一種炎癥性疾病，CTRP9可以減少白細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮，抑制血管炎癥反應(yīng)，從而提高內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞存活力〔21～24〕。除了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外，Wang等〔25〕發(fā)現(xiàn)在冠心病患者中血清CTRP9表達(dá)降低，CTRP9與冠心病危險(xiǎn)因素BMI、TNF-α、IL-6呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C和脂聯(lián)素呈正相關(guān)，提示CTRP9是冠心病的一個(gè)獨(dú)立保護(hù)因素。

SNP是在基因組內(nèi)由單個(gè)核苷酸發(fā)生的變異引起DNA堿基排列序列的變化，這種變化可影響基因的關(guān)鍵功能，使個(gè)體產(chǎn)生或者減少對該疾病的易感性。迄今為止，有關(guān)CTRP9基因的多態(tài)性尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)CTRP9這兩個(gè)位點(diǎn)與廣東地區(qū)漢族人群的冠心病沒有遺傳易感相關(guān)性。由于冠心病的發(fā)生是多基因遺傳背景因素和生活環(huán)境因素相互影響的結(jié)果，不同人種、不同民族、不同地區(qū)的遺傳背景和環(huán)境危險(xiǎn)因素都各不相同。本研究收集的資料均來源于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和佛山市第一人民醫(yī)院的廣東地區(qū)漢族人群，樣本數(shù)也有一定的局限性。因此，還有待在不同人種、不同民族、不同地區(qū)和更大的樣本例數(shù)中，進(jìn)一步探討CTRP9(rs6583、rs9553238)與冠心病遺傳易感的關(guān)系。

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〔2016-06-17修回〕

(編輯 曲 莉)

國家自然科學(xué)基金(81370456)；廣東省揚(yáng)帆計(jì)劃培養(yǎng)高層次人才項(xiàng)目(4YF16006G)；東莞市社會科技發(fā)展項(xiàng)目(2015108101015，2013108101057)

熊興東(1978-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事衰老及老年性疾病的分子機(jī)制研究。

梁麗麗(1991-)，女，在讀碩士，主要從事衰老及老年性疾病的分子機(jī)制研究。

R349.3

A

1005-9202(2017)01-0067-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.029

1 廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 2 廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所