芹菜素與老年大鼠缺血心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的相關性

朵 杰 汪曉洲

(青海省心腦血管病專科醫院高血壓科,青海 西寧 810000)

芹菜素與老年大鼠缺血心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的相關性

朵 杰 汪曉洲

(青海省心腦血管病專科醫院高血壓科,青海 西寧 810000)

目的 對芹菜素與老年大鼠缺血心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax、半胱天冬酶(Caspase)-3表達相關性進行研究。方法 選取選擇健康的老年大鼠60只，隨機分為正常組、假手術組、心肌缺血再灌注組和不同劑量芹菜素組各10只。制作缺血再灌注模型采用結扎左冠狀勤脈前降支,心肌缺血30 min,再灌注2 h。假手術組只穿線不結扎，余各組在缺血前10 min股靜脈分別注射生理鹽水、聚乙二醇、低劑量、中劑量、高劑量芹菜素，檢測缺血心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達。結果 正常組和假手術組的凋亡細胞數極少；心肌缺血再灌注組的凋亡細胞數量明顯的增多，芹菜素低劑量(1 mg/kg)組：Apil1、芹菜素中劑量(2 mg/kg)組：Apil2、芹菜素高劑量(4 mg/kg)組：Apil4的凋亡的凋亡細胞數下降，其中芹菜素高劑量(4 mg/kg)組：Apil4的凋亡細胞數下降明顯。心肌缺血再灌注組的Bcl-2、Bax、Caspase-3、AR與正常組、假手術組、芹菜素高、中、低劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。芹菜素低劑量組Bcl-2、Bax、Caspase-3、AR與正常組、假手術組、心肌缺血再灌注組、芹菜素高劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。芹菜素中劑量組Bcl-2、Bax、Caspase-3、AR與正常組、假手術組、心肌缺血再灌注組、芹菜素高劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。且芹菜素低劑量組的Bax、AR與芹菜素中劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 芹菜素與缺血心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達存在相關性，且芹菜素可以減輕心肌損傷。

芹菜素；缺血心肌細胞；Bcl-2；Bax；Caspase-3

芹菜素是一種存在于植物中的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等作用〔1〕。芹菜素可以抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移，誘導腫瘤細胞的凋亡等〔2，3〕。細胞凋亡與心血管疾病之間存在著較大的聯系，以往研究認為心肌缺血、再灌注損傷時造成心肌細胞死亡的形式為壞死，氧化應激、負荷過重等不僅會造成心肌細胞的壞死，還可以誘導心肌細胞的凋亡〔4，5〕。芹菜素對心肌缺血、再灌注損傷有保護作用。本文對芹菜素和老年大鼠缺血心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax、半胱天冬酶(Caspase)-3表達相關性進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康老年大鼠60只，體重200～250 g，將其隨機分為6組，正常組、假手術組、心肌缺血再灌注組、芹菜素低劑量(1 mg/kg)組、芹菜素中劑量(2 mg/kg)組、芹菜素高劑量(4 mg/kg)組。

1.2 實驗材料和儀器 芹菜素(純度≥98%、陜西慧科植物開發有限公司生產，批號：AP20090727)；細胞凋亡原位檢測試劑盒(Roche公司生產)；Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體、SP試劑盒(博奧森林生物技術有限公司生產)；10%甲醛溶液(自制)；生物信號采集分析系統(澳大利亞埃德儀器國際貿易有限公司生產)；精密天平(型號：Sartorious BS124S)，動物人工呼吸機(成都泰盟科技有限公司生產，型號：HX-300)；電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；石蠟切片機(生產企業：浙江金華益迪醫療設備廠)。

1.3 實驗方法 大鼠采用烏拉坦麻醉，記錄Ⅱ導聯心電圖，頸部正中切口，氣管插管，連接呼吸機。在胸部左側開胸，人工呼吸頻率60次/min，通氣量20 ml/kg，輕壓胸廓，擠出心臟，左冠狀動脈起始下方采用醫用無損傷縫合針進針，1號絲線穿過冠狀動脈前降支下。心臟復位，穩定10 min后，股動脈給藥。正常組推注體積容積聚乙二醇(PEG)400和10%無水乙醇，假手術組穿線后10 min股動脈推注等體積生理鹽水4 ml/kg，心肌缺血再灌注組缺血前10 min股動脈推注4 ml/kg生理鹽水，芹菜素各劑量組缺血前10 min股動脈推注1、2、4 mg/kg芹菜素。正常、假手術組縫合線空置，其他組10 min之后拉緊縫合線，實施壓迫結扎左冠狀動脈前降支45 min后，結扎線放松，進行2 h的觀察，并實施肢體Ⅱ導聯心電圖、頸動脈血壓觀察。老年大鼠在實驗中，結扎成功的標準為：左心室前壁發紺、同步心電圖Ⅱ導聯ST段增高。再灌注成功的標準為：左心室前壁由發紺逐漸紅潤、ST段降低1/2。細胞凋亡標記及半定量分析：針對老年大鼠組織中石蠟包埋的心肌組織，使用末端脫氧核苷酸轉移酶介導帶熒光dUTP缺口末端標記法進行檢測，根據測定的細胞凋亡陽性分布情況，記錄每個視野中30個心肌細胞中陽性細胞數，針對平均陽性細胞所占的百分比進行計算，并將其作為細胞凋亡率(AR)。

1.4 Bcl-2、Bax、Caspase-3表達測定 選擇上述石蠟標本的相應部位，連續切片5張，采用氧化物酶標記的鏈霉卵白素(SP)法進行免疫組化染色、二氨基聯苯胺(DAB)顯色法檢驗，在每一張切片的陽性表達區域，選擇10個無重疊視野，使用圖像分析儀器進行分析，記錄光密度值均值。心肌組織切片HE染色之后，對其心肌組織的病理性損傷改變進行觀察分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 心肌細胞凋亡分析 心肌組織細胞凋亡細胞呈現棕色，正常的細胞核染藍色。正常組和假手術組凋亡細胞數極少；心肌缺血再灌注組凋亡細胞數量明顯增多。見圖1。

2.2 Bcl-2、Bax、Caspase-3表達分析 心肌缺血再灌注組的AR值顯著高于其他組(P<0.05)。芹菜素低劑量組AR顯著高于正常組、假手術組、芹菜素中、高劑量組(P<0.05)。芹菜素中劑量組AR顯著高于正常組、假手術組、芹菜素高劑量組(P<0.05)。心肌缺血再灌注組Bcl-2顯著高于正常組和假手術組(P<0.05)，顯著低于芹菜素各劑量組(P<0.05)。芹菜素不同劑量組Bcl-2兩兩差異顯著(P<0.05)，芹菜素高劑量組Bcl-2顯著高于其他組(P<0.05)。心肌缺血/再灌注組Caspase-3顯著高于正常組、假手術組、芹菜素低劑量(P<0.05)。芹菜素各劑量組Caspase-3均顯著高于正常組和假手術組(P<0.05)，芹菜素不同劑量組Caspase-3兩兩差異顯著(P<0.05)，芹菜素中劑量組Caspase-3顯著高于其他組(P<0.05)。心肌缺血再灌注組的Bax顯著高于其他組(P<0.05)。不同劑量芹菜素組Bax兩兩差異顯著(P<0.05)，芹菜素低劑量組Bax顯著高于正常組、假手術組、芹菜素高、中劑量組(P<0.05)。正常組和假手術組Bax顯著低于其他組(P<0.05)。見表1。

圖1 各組心肌缺血再灌注細胞凋亡影響(TUNEL,×400)

組別Bcl-2(OD)Bax(OD)Caspase-3(OD)AR(%)正常組0.11±0.013)0.07±0.013)0.05±0.013)0.02±0.013)假手術組0.12±0.023)0.08±0.013)0.06±0.013)1.22±0.121)3)心肌缺血再灌注組0.23±0.041)2)1.06±0.131)2)0.18±0.021)2)29.78±1.351)2)芹菜素低劑量組0.31±0.031)2)3)0.55±0.111)2)3)0.10±0.011)2)3)22.16±1.141)2)3)芹菜素中劑量組0.34±0.041)2)3)0.32±0.061)2)3)4)0.93±0.021)2)3)15.46±0.571)2)3)4)芹菜素高劑量組0.41±0.051)2)3)4)5)0.12±0.021)2)3)4)5)0.61±0.021)2)3)4)5)6.57±0.551)2)3)4)5)

與正常組比較:1)P<0.05；與假手術組比較:2)P<0.05；與心肌缺血再灌注組比較:3)P<0.05；與芹菜素低劑量組比較:4)P<0.05；與芹菜素中劑量組比較:5)P<0.05

2.3 心肌組織病理學分析 正常組和假手術組心肌纖維著色不均勻，且排列紊亂心肌細胞呈現大片狀的死亡，界限不清，細胞核有破裂、溶解、消失現象。芹菜素低劑量和中劑量組心肌纖維著色不均，排列紊亂，且心肌細胞中水腫，空泡樣改變，細胞核有濃縮、溶解、消失現象，有少量炎性細胞浸潤。芹菜素高劑量組心肌肌纖維相對完整，排列較為整齊，著色均勻。細胞核有濃縮、溶解現象。芹菜素劑量可以依賴性地減輕心肌細胞損傷的病理學形態變化。見圖2。

圖2 各組心肌組織病理形態學變化(HE，×400)

3 討 論

芹菜素在各種疾病的治療中，尤其是腫瘤疾病、心血管疾病的治療中，有良好的作用〔6〕。芹菜素自身有多種藥理作用，在心肌細胞凋亡、抗腫瘤、抗炎等方面有顯著的效果〔7〕。芹菜素是一種在水果、蔬菜中廣泛存在的一種黃酮類化合物，相關實驗研究證明，芹菜素在抑制腫瘤細胞的生長、誘導凋亡中起著重要的作用〔8〕。

芹菜素可以擴張血管，對血脂、血壓進行調節，保護血管內皮細胞等，將芹菜素用于老年心血管疾病等治療中，有顯著的治療效果〔9，10〕。芹菜素是一種天然的抗氧化劑，其在抗病毒、抗炎、抗腫瘤等方面有顯著的作用，芹菜素可以改善血管內皮細胞的收縮功能，具有抗心律失常、心肌梗死等作用，可以縮小心肌缺血/再灌注損傷面積，對心肌缺血/再灌注損傷起到有效的保護作用〔11，12〕。

細胞的凋亡受到細胞內凋亡調節蛋白的調控，Bcl-2、Bax是兩種凋亡調節蛋白，在細胞的凋亡中起著關鍵性的作用，Bcl-2、Bax的高低，與細胞凋亡存在直接的關系，Bax升高則會加速細胞的凋亡，Bcl-2的升高，則會抑制細胞的凋亡，所以細胞受到凋亡刺激之后，其生存率受到Bcl-2、Bax的影響。Caspase-3是下游階段中關鍵的凋亡蛋白酶，Caspase-3蛋白酶的激活，會抑制細胞的凋亡。

1 任環宇,唐修文.芹菜素對肺癌細胞的抗增殖作用和抗腫瘤藥物的增敏作用〔J〕.浙江大學學報(醫學版),2011;40(5):508-14.

2 潘 倫,徐 溢.芹菜素抗腫瘤作用的研究狀態〔J〕.中國醫藥指南,2009;7(12):57-8,96.

3 張慧芝,白建平,于肯明,等.芹菜素預處理對缺血再灌注大鼠心肌腫瘤壞死因子-α表達的影響〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志,2011;9(7):834-5.

4 高瑞林,李毅寧,張建育,等.芹菜素對膀胱癌T24細胞增殖、凋亡和CyclinD1、 Caspase-3表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(16):4569-71,4572.

5 吳華濤,馬 濤,孟 勇,等.芹菜素對腫瘤抑制作用研究進展〔J〕.中國現代醫生,2009;47(6):41-2,44.

6 潘雪刁,楊周萍,周四桂,等.芹菜素對人肺癌 A549細胞凋亡及相關蛋白 Bax、Bcl-2表達的影響〔J〕.中國醫藥生物技術,2013;33(4):259-63.

7 陳 寧,葉麗紅.芹菜素抑制腫瘤細胞增殖機制研究進展〔J〕.環球中醫藥,2014;7(2):151-4.

8 劉博文,張 斌,陳祖錦,等.芹菜素抗腫瘤機制研究進展〔J〕.國際腫瘤學雜志,2010;37(11):824-7.

9 李占飛.芹菜素抗腫瘤作用及其機制研究進展〔J〕.疾病監測與控制,2013;7(10):616-8.

10 楊紅霞,孫 倩.芹菜素的現代研究進展〔J〕.長治醫學院學報,2012;26(5):397-400.

11 張 強,趙新淮,張 濤,等.黃酮醇化合物中B環結構與其誘導癌細胞凋亡的關系〔J〕.中國老年學雜志,2012;32(9):1865-7.

12 史婷婷,白建平,梁月琴,等.芹菜素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響〔J〕.中國藥理學通報,2011;27(5):666-71.

〔2015-02-19修回〕

(編輯 苑云杰)

朵 杰(1979-)，男，主治醫師，主要從事心血管疾病研究。

R965

A

1005-9202(2017)01-0054-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.024