全反式維甲酸對高糖誘導的HK-2細胞外基質合成的影響及可能機制

黃 翀 陳艷霞 秦曉華 鄒宏昌 徐承云 徐高四 房向東 涂衛平

(南昌大學第二附屬醫院腎內科，江西 南昌 330006)

全反式維甲酸對高糖誘導的HK-2細胞外基質合成的影響及可能機制

黃 翀 陳艷霞 秦曉華 鄒宏昌 徐承云 徐高四 房向東 涂衛平

(南昌大學第二附屬醫院腎內科，江西 南昌 330006)

目的 探討全反式維甲酸(ATRA)對高糖誘導HK-2細胞外基質合成的影響及其在延緩糖尿病腎病腎間質纖維化中的可能作用機制。方法 將體外培養的HK-2細胞隨機分為七組：A組(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、B組(30 mmol/L D-葡萄糖)、C組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)、D組(10-7mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、E組(10-6mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、F組(10-5mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、G組(10 μmol/L Y-27632+30 mmol/L高糖)，各組細胞均培養48 h。應用ELISA 法檢測細胞培養液結締組織生長因子(CTGF)和Ⅳ型膠原的表達水平；RT-PCR法檢測細胞RhoA、ROCK1的表達水平。結果 B組RhoA mRNA及ROCK1 mRNA 的表達較A組顯著升高(P<0.05)，D、E、F組RhoA mRNA 及ROCK1 mRNA 較B組均表達減少(P<0.05)，且隨著ATRA濃度的升高呈現劑量依賴性。G組RhoA mRNA的表達與B組無明顯差異，但ROCK1 mRNA 的表達較B組顯著減少(P<0.05)；直線相關分析顯示高糖組，D、E、F組RhoA mRNA 與ROCK1 mRNA 表達呈正相關(r=0.854,P=0.030;r=0.895,P=0.016;r=0.883,P=0.020;r=0.867,P=0.025)；ELISA 結果顯示D、E、F組及G組CTGF、Ⅳ型膠原表達較B組顯著下降(P<0.05)，且下降程度與ATRA濃度呈現劑量相關性。結論 ATRA在一定濃度范圍內可抑制高糖誘導的HK-2細胞外基質的合成，延緩腎間質纖維化，其機制可能與抑制RhoA/ROCK通路有關。

高糖；全反式維甲酸；RhoA/ROCK信號通路；HK-2細胞

腎間質纖維化(RIF)是各種慢性腎臟病(CKD)發展的最終病理結果。肌成纖維細胞(MF)的產生與活化引起細胞外基質的過多沉積被認為是RIF發生的主要機制。MF主要通過腎小管上皮細胞間充質轉分化(EMT)而來，而纖維連接蛋白(FN)、肺纖維化結締組織生長因子(CTGF)和Ⅳ型膠原等均是EMT形成的重要生物標記物。近些年研究報道，轉化生長因子(TGF)β/smad信號通路可通過促進EMT的形成觸發RIF的發生，且RhoA/ROCK信號通路與TGFβ/smad信號通路在此過程中具有平行作用〔1〕。最近研究表明全反式維甲酸(ATRA)可抑制高糖誘導的HK-2細胞FN、層黏連蛋白(LN)的合成而延緩糖尿病腎病(DN)腎臟纖維化的發生〔2〕。然而，目前ATRA可否通過Rho/ROCK信號通路影響高糖誘導的RIF的報道甚少。本文擬探討ATRA對CKD保護性生物學效應的相關機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 HK-2細胞株(ATCC細胞庫)；ATRA、Rho 激酶抑制劑Y27632、D-葡萄糖、甘露醇(美國Sigma公司)；DMEM/F12培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；酶標儀(美國 Thermo公司)，RNA逆轉錄試劑盒(日本Takara公司)，ELISA試劑盒(武漢優爾生商貿有限公司)。

1.2 細胞培養及實驗分組 用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養HK-2 細胞株，在適宜環境下(37℃、5%CO2)待細胞生長至約70%～ 80%融合后接種入6孔培養板中繼續培養，待至80% 融合后用無血清DMEM/F12同步生長48 h。隨機將細胞分為七個實驗組：A組(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、B組(30 mmol/L D-葡萄糖)、C組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)、D組(10-7mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、E組(10-6mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、F組(10-5mol/L ATRA+30 mmol/L高糖)、G組(10 μmol/L Y-27632+30 mmol/L高糖且Y-27632提前30 min 加入)，各組細胞均培養48 h。每次實驗均重復3 次。

1.3 ELISA法定量檢測蛋白表達水平 收集干預48 h后的細胞培養上清液，按ELISA 試劑盒操作說明進行稀釋、加樣，讀取波長為450 nm時的OD值，用EXCEL繪制標準曲線，根據標準曲線方程求出各樣品CTGF和Ⅳ型膠原表達濃度。

1.4 RT-PCR檢測 由美國 Invitrogen公司設計合成RhoA、ROCK1、β-actin引物各一對，序列見表1。反應條件:94℃預變性5 min，55℃退火30 s，72℃延伸7 min，共35個循環。配制2%瓊脂糖凝膠，PCR 產物電泳儀內90 V，30 min完成電泳后在凝膠成像系統成像并使用Quantity One軟件進行數據分析。

表1 引物序列

基因引物序列產物(bp)RhoA正義5'-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3'356反義5'-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3'ROCK1正義5'-TGATGGCTATTATGGACGAG-3'293反義5'-GGAGCGTTTCCCAAGC-3'β-actin正義5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'434反義5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件行單因素方差分析，t檢驗；相關性分析采用Pearson直線相關分析。

2 結 果

2.1 高糖和ATRA對RhoA、ROCK1 mRNA表達的影響 B組RhoA及ROCK1 mRNA的表達均較A組明顯升高(P<0.05)，D、E、F組RhoA及ROCK1 mRNA 均較B組的表達顯著減少(P<0.05)，且與ATRA濃度呈現一定的劑量依賴性。G組RhoA mRNA的表達與B組無明顯差異，但ROCK1 mRNA 的表達較B組顯著減少(P<0.05)。見表1，圖1。

2.2 相關性分析 直線相關分析顯示B、D、E、F組RhoA mRNA 與ROCK1 mRNA 表達呈正相關(r=0.854,P=0.030;r=0.895,P=0.016;r=0.883,P=0.020;r=0.867,P=0.025)。

2.3 高糖和ATRA對CTGF、Ⅳ型膠原表達的影響 D、E、F組及G組CTGF、Ⅳ型膠原表達較高糖組均顯著下降(P<0.05)，且下降程度與ATRA濃度相關。見表2。

組別RhoAmRNAROCK1mRNAA組0.249±0.0070.356±0.009B組0.548±0.0191)0.936±0.0111)C組0.248±0.0020.352±0.011D組0.482±0.0121)2)0.687±0.0091)2)E組0.392±0.0101)2)3)0.384±0.0091)2)3)F組0.276±0.0121)2)3)4)0.257±0.0101)2)3)4)G組0.553±0.0171)0.143±0.0122)

與A組比較:1)P<0.05；與B組比較:2)P<0.05；與D組比較:3)P<0.05；與E組比較:4)P<0.05；下表同

圖1 各組RhoA mRNA 及ROCK1 mRNA 的表達水平

組別CTGF(ng/ml)Ⅳ型膠原(ng/ml)A組64.656±2.18247.520±0.922B組692.930±6.8961)383.203±8.1231)C組67.056±2.54547.370±0.356D組375.896±6.4381)2)313.883±8.3861)2)E組204.900±5.1181)2)3)226.276±1.5571)2)3)F組134.906±4.7471)2)3)4)151.78±0.6621)2)3)4)G組235.310±5.8891)2)81.893±0.6601)2)

3 討 論

DN是糖尿病全身微血管病變之一，是糖尿病常見的嚴重并發癥之一，也是導致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一。既往研究報道，腎小球病變是DN發生的主要原因，而近年發現腎小管病變和腎間質纖維化與DN的預后有著更為密切的關系，且國內外研究表明高糖可誘導EMT的發生，最終道導致RIF的形成〔3,4〕。EMT的發生涉及多個細胞內信號轉導途徑，TGFβ/smad是在介導EMT時被研究較為廣泛的信號通路之一。近年有研究認為〔1〕，EMT過程涉及的眾多的信號通路中，RhoA/ROCK與TGFβ/smad是兩條重要且平行的信號通路。Raquel等〔5～7〕通過使用RhoA/ROCK特異性阻斷劑證實RhoA/ROCK在血管緊張素Ⅱ導致的EMT中起關鍵作用，其機制可能與Rho激酶抑制劑阻斷了腎臟細胞外基質合成有關。本實驗發現高糖可通過RhoA/ROCK通路誘導Ⅳ型膠原的合成，使HK-2細胞外基質累積，進而引起腎小管間質纖維化。而使用Rho激酶抑制劑后，Ⅳ型膠原的表達較高糖誘導組顯著減少，這意味著RhoA/ROCK通路在高糖誘導的腎間質纖維化中起重要作用。

ATRA是維生素在體內的天然活性衍生物，在細胞分化和維持內環境方面發揮著廣泛的效應。ATRA是一組核受體家族的配體，通過激活維甲酸受體(RAR)和維甲酸X受體(RXR)，調控機體多種基因的表達，完成多種生物學效應〔8〕。近年來ATRA在RIF形成機制的研究中成為熱點，Zhou等〔9〕研究發現ATRA能延緩單側輸尿管梗阻大鼠的腎間質纖維化，進一步的研究表明低表達的RARα/RARβ與大鼠RIF進展中的細胞外基質的積聚相關，這些均提示RARα/RARβ可成為預防腎間質纖維化新的治療靶點〔10〕。有學者通過ATRA作用于糖尿病大鼠模型時發現，ATRA可緩解糖尿病大鼠早期腎臟損傷,并減少細胞外膠原基質的過度累積,最終延緩腎臟纖維化〔11〕。本研究提示ATRA參與緩解高糖刺激下的腎小管間質纖維化；同時，Person相關分析結果推測ATRA的保護作用與RhoA/ROCK通路有關。本實驗顯示給予高糖刺激后RhoA mRNA 和ROCK1 mRNA表達增強，加入ATRA干預后，其表達隨ATRA濃度的增加而逐漸減弱。ATRA通過RhoA/ROCK通路發揮保護作用的具體機制有待進一步研究。

1 Das S,Becker BN,Hoffmann FM,etal.Complete reversal of epithelial to mesenchymal transition requires inhibition of both ZEB expression and the Rho pathway〔J〕.BMC Cell Biol,2009;10(1):94.

2 孟 雪,郭漢城,關天俊.全反式維甲酸對高糖誘導HK-2細胞FN、LN表達的影響〔J〕.臨床醫學工程,2011;18(7):992-4.

3 Lee YJ,Han HJ.Troglitazone ameliorates high glucose-induced EMT and dysfunction of SGLTs through PI3K/Akt,GSK-3β,Snail1,and β-catenin in renal proximal tubule cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;298(5):F1263-75.

4 Alisson-Silva F,Freire-de-Lima L,Donadio JL,etal.Increase of O-glycosylated oncofetal fibronectin in high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition of cultured human epithelial cells〔J〕.PLoS One,2013;8(4):e60471.

5 Raquel RD,Carrajal-Gonzalez G,Samchez-Lopez E,etal.Pharmacological modulation of epithelial mesenchymal transition caused by angiotensinⅡ.Role of ROCK and MAPK pathways〔J〕.Pharm Res,2008;25(10):2447-61.

6 Zuehlke J,Ebenau A,Krueger B,etal.Vectorial secretion of CTGF as a cell-type specific response to LPA and TGF-β in human tubular epithelial cells〔J〕.Cell Commun Signal,2012;10(1):25.

7 Kroening S,Neubauer E,Wullich B,etal.Characterization of connective tissue growth factor expression in primary cultures of human tubular epithelial cells:modulation by hypoxia〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;298(3):796-806.

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9 Zhou TB,Qin YH,Li ZY,etal.All-transretinoic acid treatment is associated with prohibitin expression in renal interstitial fibrosis rats〔J〕.Int J Mol Sci,2012;13(3):2769-82.

10 Long YB,Qin YH,Zhou TB,etal.Association of retinoic acid receptors with extracellular matrix accumulation in rats with renal interstitial fibrosis disease〔J〕.Int J Mol Sci,2012;13(11):14073-85.

11 姚春萌,郭漢城,黃清河,等.全反式維甲酸延緩糖尿病腎臟纖維化進展的實驗研究〔J〕.中國中西醫結合腎病雜志,2009;10(2):124-6.

〔2015-12-30修回〕

(編輯 袁左鳴)

江西省衛生廳科技計劃(20151BBG70173)

涂衛平(1960-)，男，主任醫師，主要從事腎間質纖維化研究。

黃 翀(1985-)，女，主治醫師，主要從事慢性腎臟病防治研究。

R587.2；R965

A

1005-9202(2017)01-0038-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.016