曲克蘆丁和苦蕎對大鼠酒精性脂肪肝的保護作用

閆帥峰 王繼紅 劉 莉 楊升東 楊耀瑋 孫麗君 文 童

(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院，重慶 400016)

曲克蘆丁和苦蕎對大鼠酒精性脂肪肝的保護作用

閆帥峰 王繼紅1劉 莉1楊升東 楊耀瑋 孫麗君 文 童2

(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院，重慶 400016)

目的 觀察苦蕎對酒精性脂肪肝模型大鼠的影響。方法 用飲用酒灌胃方法建立大鼠酒精性脂肪肝模型。將造模成功的大鼠隨機分為苦蕎組、葛根素組、曲克蘆丁組、模型組,同期設(shè)立空白對照組。苦蕎組用苦蕎粉灌胃8 w，葛根素組和曲克蘆丁組分別給予葛根素腹腔注射8 w。檢測各組大鼠血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量，并計算肝臟指數(shù)。HE染色觀察大鼠肝臟的病理變化。結(jié)果 與模型組相比，給藥組血清中AST、γ-GT、ALT活力均顯著降低(P<0.05)，且苦蕎組效果優(yōu)于葛根素組(P<0.05)。病理組織學(xué)檢查顯示給藥組由脂肪蓄積導(dǎo)致的氣球樣變細胞明顯減少，腫脹細胞數(shù)量減少，炎癥細胞浸潤減輕，肝竇內(nèi)無瘀血。結(jié)論 苦蕎和曲克蘆丁可以減少脂肪在大鼠肝臟中的蓄積，改善肝功能，對酒精性脂肪肝有明顯保護作用。

酒精性脂肪肝；苦蕎；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶

酒精性肝病(ALD)中酒精性脂肪肝(AFLD)的發(fā)病率為22.6%，而酒精性肝硬化的死亡率達23%～50%〔1，2〕，因此乙醇對肝臟的毒性作用不可忽視。研究探討解酒保肝的保健食品和藥品成為醫(yī)學(xué)及營養(yǎng)界共同關(guān)注的課題。本文探討苦蕎和曲克蘆丁對AFLD的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料藥品與儀器 SD雄性大鼠(重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)；注射用曲克蘆丁(晉城海斯制藥)和葛根素(北京四環(huán)科寶制藥)；苦蕎粉(四川涼山)；56°紅星二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司)；酶學(xué)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。酶標儀(BIO-TEK INSTRUMENTS,INC ELX80)，石蠟切片機(Taiva-R135)，顯微鏡(OLYMPUS BX40F4)，離心機(Eppendorf5415R)。

1.2 分組和方法 55只SD大鼠隨機分為空白對照組10只和造模組45只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，造模組按照12 ml·kg-1·d-1連續(xù)灌胃10 w〔3〕。10 w后從造模組隨機抽取5只取肝臟做病理檢查，證實造模成功。第11周將剩余的造模成功的40只大鼠隨機分為模型組、葛根素組，曲克蘆丁組和苦蕎組。葛根素組按照40 mg·kg-1·d-1；曲克蘆丁組按照50 mg·kg-1·d-1；苦蕎組按照苦蕎粉10 g·kg-1·d-1連續(xù)腹腔注射8 w。模型組每天給予相同體積的生理鹽水進行腹腔注射。所有動物每周日稱取體重1次，并且按照體重變化調(diào)整給藥劑量。

1.3 血清酶學(xué)檢測 每只大鼠禁食12 h，下腔靜脈采血，37℃孵育30 min，3 500 r/min 離心5 min,測定血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性。

1.4 肝臟指數(shù) 稱取每只大鼠質(zhì)量，取血后立即處死，稱肝臟質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)=肝臟濕重/體質(zhì)量×100%)。

1.5 病理學(xué)檢查 用20%烏拉坦按照0.4 ml/100 g的劑量麻醉每只大鼠，取肝左葉固定于10%甲醛溶液、石蠟包埋、切片、HE染色，400倍光鏡下觀察各組的病理學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般體征、體質(zhì)量、肝指數(shù)檢測 空白對照組大鼠呈現(xiàn)皮毛柔順有光澤，對外界刺激反應(yīng)靈敏，進食、飲水、糞便等活動自如。模型組大鼠少動，刺激后反應(yīng)遲鈍，步態(tài)不穩(wěn)，少數(shù)大鼠出現(xiàn)狂躁現(xiàn)象，互相撕咬，灌胃5 w左右各大鼠出現(xiàn)了毛皮粗糙且漸漸失去光澤，大便稀溏。模型組體質(zhì)量減輕(P<0.05)。模型組大鼠肝臟標本體積明顯增大，顏色泛黃，質(zhì)地變軟，密度變小，肝臟切面有油膩感，病理切片也顯示其肝索肝竇分界不清晰，肝細胞核被細胞質(zhì)內(nèi)的脂滴擠向細胞一側(cè)，發(fā)生氣球樣變性，在匯管區(qū)尤其明顯，脂肪變性明顯，說明造模成功。葛根素組大便、飲食、飲水等均接近空白對照組，表明葛根素對AFLD具有保護作用。曲克蘆丁組、葛根素組和苦蕎組大鼠的體質(zhì)量均較模型組上升、肝臟指數(shù)有所下降(P<0.05)，說明曲克蘆丁、苦蕎、葛根素組對AFLD有保護作用。見表1。

與模型組比較：1)P<0.05；2)P<0.01

2.2 血清AST、ALT、γ-GT活性測定 模型組與空白對照組比較AST、ALT、γ-GT活性均顯著增高(P<0.01)，說明模型組大鼠肝臟明顯損害，支持造模成功；葛根素組、曲克蘆丁組和苦蕎組的AST、ALT、γ-GT活性均較模型組顯著下降(P<0.01)，進一步說明葛根素、曲克蘆丁和苦蕎確實能夠減輕大鼠AFLD損害。另外，苦蕎組γ-GT活性比曲克蘆丁組低(P<0.01)；同時苦蕎組ALT活性也比曲克蘆丁組低(P<0.05)，說明苦蕎保護肝臟的效果優(yōu)于葛根素。見表2。

組別γ-GTASTALT空白對照組33.33±7.661)58.49±11.391)47.87±14.551)模型組73.47±6.50106.44±17.47100.80±19.45葛根素組49.18±9.621)75.71±14.351)65.85±16.801)曲克蘆丁組42.55±10.131)74.86±21.941)55.38±10.831)苦蕎組37.53±6.431)3)75.81±12.611)50.48±8.551)2)

與模型組比較:1)P<0.01；與曲克蘆丁組比較:2)P<0.05；3)P<0.01

2.3 病理組織學(xué)檢查

2.3.1 大體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 空白對照組大鼠的肝臟外觀顏色呈紅褐色，質(zhì)地柔軟而且有彈性，大小正常，切面無油膩感。模型組大鼠肝臟體積明顯增大，顏色泛黃，切面有油膩感，質(zhì)地韌性明顯增加。葛根素組、曲克蘆丁組和苦蕎組肝臟大小接近正常，質(zhì)地軟且有彈性，顏色呈紅褐色，切面類似空白對照組，油膩感不明顯。

2.3.2 顯微形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 空白對照組肝細胞形態(tài)以及排列正常，肝索肝竇分界清晰，未見炎癥細胞浸潤和肝細胞變性及壞死。模型組大鼠肝鏡下呈現(xiàn)肝索肝竇分界不清晰，肝細胞核被細胞質(zhì)內(nèi)的脂滴擠向細胞一側(cè)，發(fā)生氣球樣變性，在匯管區(qū)尤其明顯，脂肪變性明顯。曲克蘆丁組、葛根素組和苦蕎組與空白對照組比較脂肪變性情況均明顯減輕，肝細胞形態(tài)基本正常，肝索和肝竇清晰。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理學(xué)變化(HE，×400)

3 討 論

脂肪肝形成主要有兩個原因，其一是酒精的毒性造成了肝細胞內(nèi)脂肪酸氧化障礙發(fā)生蓄積，以及脂肪合成酶亢進，導(dǎo)致肝中脂肪蓄積；另一原因是酒精代謝產(chǎn)物的肝毒性。酒精代謝產(chǎn)物如乙醛等與谷胱甘肽結(jié)合，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使體內(nèi)丙二醛(MDA)生成增多，MDA可以誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。同時酒精在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物本身也可以作為半抗原誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。所以酒精的肝毒性一方面導(dǎo)致肝脂肪生成量增加，并且在肝中蓄積誘發(fā)脂肪肝；另一方面酒精的代謝產(chǎn)物可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，引起肝細胞損傷，進而造成肝細胞氧化脂肪酸受阻，加重脂肪肝。而且由此導(dǎo)致的肝損傷可誘導(dǎo)肝纖維化，致發(fā)生肝硬化〔4，5〕。血清ALT水平能夠較敏感地反映肝細胞損害情況。AFLD時ALT升高能夠說明肝功能已經(jīng)受到酒精的影響；AST主要存在于線粒體，正常情況下血清含量不高，只有在肝臟細胞受到較嚴重損傷時才會明顯升高。AST和ALT活性是反映肝細胞損傷最敏感的指標之一，兩者水平常常被作為藥物對肝臟是否具有保護作用的指標。血清γ-GT主要來源于肝膽系統(tǒng)，大量持續(xù)飲酒可引起其水平升高，相比于AST和ALT它是診斷酒精性肝損害較為敏感和特異的指標。本研究結(jié)果說明葛根素、曲克蘆丁和苦蕎能夠明顯改善AFLD，保護肝功能方面苦蕎的作用優(yōu)于曲克蘆丁。葛根素是從葛根中提取的一類黃酮類化合物的總稱，對AFLD有一定的療效。曲克蘆丁具有抗氧化作用，能夠清除由于氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的過多自由基和超氧離子，有減弱氧化應(yīng)激的作用，同時它還具有抗炎作用〔6〕。目前市面上有多種苦蕎相應(yīng)的產(chǎn)品，老百姓容易獲取并方便使用，而且價格低廉，在治療預(yù)防AFLD方面具有很大的推廣應(yīng)用價值。本實驗顯示苦蕎作用于AFLD模型鼠效果與曲克蘆丁和葛根素相似，其機制是否與其具有抗氧化應(yīng)激作用，減輕酒精及其代謝產(chǎn)物對肝臟的損害作用有關(guān)有待進一步研究。

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〔2015-07-07修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

重慶市大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(201310631011)；重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新實驗重點項目(201310)；重慶市科委自然科學(xué)基金(CSTC,2008CE9142)

王繼紅(1955-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

閆帥峰(1991-)，男，碩士，主要從事骨外科學(xué)研究。

R575.5

A

1005-9202(2017)01-0036-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.015

1 重慶醫(yī)科大學(xué)實驗中心生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室 2 重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院