千金片對慢性盆腔炎大鼠Th1/2型細胞因子表達的影響

趙 杰 劉 芳

(內蒙古醫科大學附屬醫院生殖中心，內蒙古 呼和浩特 010050)

千金片對慢性盆腔炎大鼠Th1/2型細胞因子表達的影響

趙 杰 劉 芳

(內蒙古醫科大學附屬醫院生殖中心，內蒙古 呼和浩特 010050)

目的 探討婦科千金片對慢性盆腔炎大鼠子宮組織及血清中輔助性T細胞(Th)1/2型細胞因子表達的影響。方法 選取84只雌性SD大鼠，選取其中72只進行慢性盆腔炎大鼠造模，造模后隨機分為模型組(等量蒸餾水)、假手術組(等量蒸餾水)、千金片高劑量組(2.08 g/kg千金片)、千金片中劑量組(1.04 g/kg千金片)、千金片低劑量組(0.52 g/kg千金片)及婦炎康組(0.41 g/kg婦炎康)各12只，其余12只作為空白組(等量蒸餾水)。治療21 d后檢測各組大鼠子宮組織及血清Th1/2型細胞因子表達情況。結果 模型組、千金片低、中、高劑量組、婦炎康組的HE染色病理學評分顯著高于空白組和假手術組(P<0.05)，千金片低、中、高劑量組、婦炎康組的HE染色病理學評分顯著低于模型組(P<0.05)，千金片低、中、高劑量組隨著千金片劑量增加，病理學評分逐漸降低(P<0.05)；模型組大鼠子宮組織中白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-8水平顯著高于空白組、假手術組(P<0.05)，IL-10水平顯著低于空白組、假手術組(P<0.05)；千金片高、中、低劑量組及婦炎康組大鼠子宮組織中IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著低于模型組(P<0.05)、IL-10水平顯著高于模型組(P<0.05)。模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平顯著高于空白組、假手術組(P<0.05)，IL-10、干擾素(IFN)-γ、IL-12水平顯著低于空白組、假手術組(P<0.05)；千金片高、中、低劑量組及婦炎康組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平顯著低于模型組(P<0.05)、IL-10、干擾素(IFN)-γ、IL-12水平顯著高于模型組(P<0.05)。結論 婦科千金片能有效抑制慢性盆腔炎大鼠IL-1β、TNF-α、IL-8水平表達，增強IL-10表達，從而達到抗炎的目的。

婦科千金片；慢性盆腔炎；輔助性T細胞；細胞因子

已婚女性由于性生活頻繁、陰道內菌群環境失調等原因，陰道炎癥以及慢性盆腔炎癥性疾病的發生率逐漸增多，臨床上可反復發生下腹部隱痛，部分患者慢性盆腔炎急性發作時可導致嚴重的全身炎癥性癥狀。目前急性期盆腔炎一般采用第二代頭孢類抗生素聯合抗厭氧菌藥物聯合治療〔1〕。婦科千金片中含有千金拔、 金櫻根、 穿心蓮等中藥成分，可以顯著改善盆腔炎急性期充血、抑制炎癥反應，進而改善患者盆腔炎癥〔2〕。但目前對于婦科千金片的作用機制尚不清楚，本文擬分析千金片對盆腔炎大鼠模型局部免疫平衡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 選取84只雌性SD大鼠，選取其中72只進行慢性盆腔炎大鼠造模，造模后隨機分為模型組、假手術組、千金片高、中、低劑量組及婦炎康組各12只，其余12只作為空白組。所有大鼠均為SPF級，平均體重(200±20)g，購自中南大學湘雅醫學院動物實驗中心〔SCXK(湘)2014-0003〕，所有大鼠喂養于12 h光照、濕度40%～60%、溫度23℃～25℃、自由進食進水的環境中。

1.2 造模方法 采用5 ml的注射空針將密度為5×106表皮葡萄球菌、 腸道埃希菌以及淋球菌性支原體混合注入培養瓶中混勻。將尾紗剪切成小塊，與培養液充分混勻。將模型鼠倒立，將紗布塞入子宮內，注意觀察有無明顯出血，可局部紗布壓迫止血，大鼠倒置5 min。1次/d，連續操作4次。假手術組塞入普通浸入生理鹽水的紗布。

1.3 實驗方法 千金片組的抗感染治療分為不同的給藥濃度，按0.52、1.04、2.08 g/kg靜脈滴注給藥，婦炎康組組按照濃度為0.41 g/kg 給予婦炎康藥液，其余各組均給予生理鹽水注射治療，1次/d，連續 治療4 w。

1.4 指標檢測方法 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測白細胞介素(IL)-10、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-8、IL-4、γ-干擾素(IFN-γ)、IL-12，1 500 r/min離心5 min后得到血清，4℃保存待測，以標準品稀釋液將標準品復溶，靜置15 min后混勻。大鼠子宮組織經過研磨后倍比稀釋為7個濃度，取出板條，除了對照孔外每孔加入不同濃度的標準品100 μl/孔，封板蓋封住，室溫反應120 min，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，除了空白對照孔，每孔加入檢測液100 μl，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，加入底物(50 μl/孔)，避光孵育25 min，加入終止液5 min后測定450 nm處吸光度。蘇木素-伊紅(HE)染色:采用石蠟脫水，微波修復，檸檬酸緩沖液98℃，5 min，之后采用3%過氧化氫抑制10 min，在50%石蠟二甲苯液中浸蠟10 min，100%石蠟液中浸蠟10 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，HE復染、脫水(85% 1次、95% 2次、無水酒精二次、無水酒精和二甲苯各半1次、純二甲苯2次),封片、鏡檢。HE染色評分標準：未見炎癥細胞浸潤計0分；子宮內膜中出現少量炎癥細胞(≤30%)計1分；子宮內膜中出現大量炎癥細胞(>30%)，腺上皮輕度增生，極性排列規則，計2分；間質出現大量的炎癥細胞浸潤(>30%)，腺上皮增生，極性排列紊亂，計3分。

1.5 統計學方法 采用SAS9.0軟件，計量指標采用F檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 HE染色病理學觀察 空白組和假手術組大鼠的子宮組織黏膜層、肌層、漿膜層組織清晰，未見炎癥細胞浸潤及炎性滲出；模型組大鼠子宮組織可見子宮黏膜上皮細胞大部分壞死脫落，腺體變形、擴張、彎曲，間質細胞減少，各層子宮組織結構紊亂、界限不清，可見纖維細胞增生及大量炎性細胞浸潤及炎性滲出；隨著千金片劑量增加，大鼠子宮組織較模型組改善顯著。HE染色病理學評分結果可見，模型組〔(2.63±0.61)分〕、千金片低〔(2.13±0.57)分〕、中〔(1.64±0.60)分〕、高劑量組〔(0.75±0.42)分〕、婦炎康組〔(0.78±0.35)分〕的HE染色病理學評分顯著高于空白組(0分)和假手術組(0分)(P<0.05)，千金片低、中、高劑量組、婦炎康組的HE染色病理學評分顯著低于模型組(P<0.05)，千金片低、中、高劑量組隨著千金片劑量增加，病理學評分逐漸降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組HE染色病理學觀察(HE，×200)

2.2 各組大鼠血清中Th1/2細胞因子的表達情況 模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平顯著高于空白組、假手術組(P<0.05)，IL-10、IFN-γ、IL-12水平顯著低于空白組、假手術組(P<0.05)；千金片高、中、低劑量組及婦炎康組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平顯著低于模型組(P<0.05)、IL-10、IFN-γ、IL-12水平顯著高于模型組(P<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠子宮組織中Th1/2細胞因子的表達情況 模型組大鼠子宮組織中IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著高于空白組、假手術組(P<0.05)，IL-10水平顯著低于空白組、假手術組(P<0.05)；千金片高、中、低劑量組及婦炎康組大鼠子宮組織中IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著低于模型組(P<0.05)、IL-10水平顯著高于模型組(P<0.05)。見表2。

組別IL-1β(μg/L)IL-10(μg/L)IL-8(μg/L)TNF-α(μg/L)IL-4(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)IL-12(pg/ml)空白組149.3±8.975.2±6.2124.8±7.7100.2±7.321.3±5.739.6±5.244.6±7.1假手術組151.2±9.476.0±7.1125.0±8.5101.5±7.922.6±6.238.5±6.143.2±8.0模型組219.4±11.71)59.3±7.51)198.5±9.21)153.9±8.01)39.2±6.91)26.3±4.11)25.1±5.91)千金片組低劑量205.8±11.01)2)64.2±6.91)2)182.3±8.61)2)139.2±8.31)2)35.4±7.11)2)29.0±3.41)2)30.2±5.71)2)千金片組中劑量187.3±10.81)2)68.7±7.01)2)162.6±9.41)2)131.5±7.61)2)31.7±6.41)2)31.2±3.71)2)34.9±6.21)2)千金片組高劑量172.5±9.61)2)71.1±6.91)2)139.5±8.71)2)122.0±8.91)2)26.2±5.51)2)33.8±5.21)2)38.0±6.51)2)婦炎康組171.9±10.41)2)72.0±5.91)2)138.3±8.11)2)121.4±8.31)2)25.8±5.31)2)34.0±5.41)2)39.2±7.01)2)

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

組別IL-1βIL-10TNF-αIL-8空白組249.3±7.270.6±5.4121.4±7.9149.2±8.0假手術組250.4±8.171.0±6.9120.5±8.0148.7±8.1模型組332.5±15.71)60.2±6.71)167.2±9.91)251.6±9.71)千金片組低劑量313.7±14.01)2)63.2±6.31)2)161.7±8.61)2)232.8±9.41)2)千金片組中劑量287.1±11.61)2)66.9±7.11)2)154.2±7.61)2)215.7±8.91)2)千金片組高劑量264.9±12.01)2)68.5±7.01)2)137.7±8.51)2)176.5±9.31)2)婦炎康組261.8±13.51)2)68.0±5.91)2)135.8±9.01)2)178.3±8.91)2)

3 討 論

盆腔炎性疾病發病病因尚不清楚，長期的子宮內膜炎性損傷、陰道內炎癥細胞的上行性感染以及多次人流導致的宮腔操作等，均為影響盆腔炎發生的獨立因素。目前西醫對于盆腔炎的治療仍然以第二代或者第三代抗生素治療為主，但效果不甚理想，抗生素的靜脈滴注往往需要超過1 w才可見明顯臨床癥狀緩解，且癥狀消失后盆腔炎容易復發〔4〕。婦科千金片具有清熱除濕，益氣化瘀的功效，臨床上可用于濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，癥見帶下量多、色黃質稠、臭穢、小腹疼痛、腰骶酸痛、神疲乏力等，特別是對于慢性盆腔炎、子宮內膜炎、慢性宮頸炎導致的婦科癥狀具有明顯的療效〔5～7〕。IL-1β、TNF-α、IL-8等細胞因子參與到了炎癥反應的組織損傷過程，而IL-10具有抑制炎癥反應的作用。

盆腔炎對于盆腔結締組織具有反復損傷性作用，在相關炎癥細胞如IL-6以及TNF-α的作用下，結締組織細胞形態發生改變，而間質成分代償性增生。HE染色結果，提示在動物模型水平上千金片對于組織損傷的保護性作用。盆腔炎致病以及介導盆腔結締組織損傷的細胞因子包括IL-1、IL-8、TNF-α以及中性粒胞質刺激因子等，通過促進中性粒細胞以及漿細胞的趨化以及血管損傷作用，進而促進結締組織炎癥性損傷以及修復過程。抑炎細胞因子包括IL-4、IL-10等，主要抑制中性粒細胞的趨化作用而降低組織損傷程度〔8〕。模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著升高，提示了造模成功；而隨著千金片使用劑量的增加，IL-1β、TNF-α、IL-8呈現逐漸下降的趨勢，同時保護性細胞炎癥因子IL-10逐漸上升。千金片中含有的千斤拔、金櫻根、穿心蓮，可以“清熱除濕，益氣化瘀”，調節盆腔局部炎癥病變區域的血流以及微環境中的免疫平衡，促進機體自身性保護性炎癥因子的釋放〔9〕，進而體現出一定的劑量依賴性，提示了在血清學水平上千金片的作用效果。組織學水平也呈現了相似的變化，提示了千金片對于盆腔炎病變組織層面的保護性作用。TNF-α在細胞炎癥損傷中通過釋放下游炎癥損傷性因子而加重組織損傷，千金片在這一過程中的作用可能與抑制TNF-α的激活以及淋巴細胞、巨噬細胞的趨化作用有關，進而降低下游IL-1β、IL-8的釋放，但其具體信號通路機制仍然需要進一步探討。

1 別斯特利科娃 т ю，尤拉索夫 и в，尤拉索娃 е а，等.腸道微生物菌群致盆腔炎性疾病及抗生素的敏感性研究〔J〕.哈爾濱醫科大學學報,2013;47(6):561-2.

2 雷 英，王 辰，薛鳳霞.盆腔炎性疾病的病原學〔J〕.實用婦產科雜志,2013;29(10):723-6.

3 阮亙杰，鄭 波.盆腔炎性疾病常用抗菌藥物的特點及使用方法〔J〕.實用婦產科雜志,2013;29(10):728-9.

4 謝 薇.婦科千金片聯合抗生素對慢性盆腔炎患者的療效觀察〔J〕.中醫臨床研究,2015;7(8):48-9.

5 殷燕云，周春祥，談 勇，等.盆腔炎顆粒治療盆腔炎后遺癥性不孕患者145例臨床觀察〔J〕.中醫雜志,2014;55(13):1117-9.

6 張艷靜，袁海鑫.婦科千金片聯合左氧氟沙星預防陰式子宮肌瘤剔除術后感染的療效觀察〔J〕.吉林醫學,2015;36(12):2458-9.

7 周 萍，曾志華，向陽紅.清熱利濕化瘀湯聯合針灸治療慢性盆腔炎濕熱瘀結證臨床研究〔J〕.世界科學技術-中醫藥現代化,2014;16(12):2630-5.

8 Liang Y,Gong D.Acupuncture for chronic pelvic inflammatory disease:a qualitative study of patients′ insistence on treatment〔J〕.BMC Complement Altern Med,2014;14(4):345-9.

9 馬 云，羅艷琴，宋路遙，等.菝葜治療慢性貧腔炎有效部位的藥效學篩選研究〔J〕.南方醫科大學學報，2013；33(1)：145-9.

〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

內蒙古教育廳課題(No.NJZY16118)；內蒙古醫科大學課題(No.2015ykdxkjbw23)

劉 芳(1976-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事婦產科生殖內分泌研究。

趙 杰(1979-)，男，碩士，助理研究員，主要從事輔助生殖技術研究。

R71

A

1005-9202(2017)01-0032-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.013