行為學(xué)干預(yù)對血管性癡呆大鼠神經(jīng)再生及腦組織N-myc下游調(diào)節(jié)基因1蛋白表達(dá)的影響

邢雪松 呂威力 吳溪婷

(沈陽醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034)

行為學(xué)干預(yù)對血管性癡呆大鼠神經(jīng)再生及腦組織N-myc下游調(diào)節(jié)基因1蛋白表達(dá)的影響

邢雪松 呂威力1吳溪婷2

(沈陽醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034)

目的 探討不同干預(yù)方法對血管性癡呆(VD)大鼠神經(jīng)再生及腦組織N-myc下游調(diào)節(jié)基因1(NDRG1)蛋白表達(dá)的影響。方法 雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，訓(xùn)練組，bFGF組。采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法制作大鼠VD動物模型，用HE、TTC染色法和免疫組織化學(xué)方法檢測海馬組織NDRG1蛋白的表達(dá)及穿梭箱訓(xùn)練和bFGF的干預(yù)作用。結(jié)果 腦缺血再灌注第7天缺血海馬神經(jīng)元NDRG1陽性細(xì)胞明顯增多，且隨缺血再灌注時(shí)間的延長逐漸增多，第21天達(dá)高峰。應(yīng)用穿梭箱訓(xùn)練和bFGF的干預(yù)后NDRG1陽性細(xì)胞明顯增加。結(jié)論 穿梭箱訓(xùn)練和bFGF促進(jìn)神經(jīng)再生作用可能由NDRG1信號介導(dǎo)。

行為學(xué)訓(xùn)練；N-myc下游調(diào)節(jié)基因1；神經(jīng)再生；增殖

血管性癡呆(VD)臨床表現(xiàn)除神經(jīng)系統(tǒng)定位損害的癥狀和體征外尚有一系列異常的神經(jīng)心理癥狀和精神行為，已成為繼阿爾茨海默病(AD)后的第二大癡呆疾病，老年人多見。探索VD 發(fā)病的相關(guān)因素及發(fā)病機(jī)制，以便尋求早期診斷、早期治療的有效措施已刻不容緩。N-myc 下游調(diào)節(jié)基因(NDRG)1〔1～3〕產(chǎn)物在多數(shù)組織中均有表達(dá)，主要參與細(xì)胞的生長發(fā)育及分化成熟，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔4～6〕。NDRG1主要分布在腎、腦、心和胎盤等，可能在組織發(fā)育過程中發(fā)揮不同的作用〔7～9〕。本研究利用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法制作大鼠VD動物模型，檢測NDRG1在VD海馬組織中的表達(dá)及穿梭箱訓(xùn)練和bFGF的干預(yù)作用，探討不同干預(yù)方法對VD大鼠神經(jīng)再生及腦組織NDRG1蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 VD模型的制備 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、訓(xùn)練組及bFGF組。模型組、訓(xùn)練組和bFGF組按再灌注時(shí)間點(diǎn)分為以下各亞組：再灌注后3、7、14、21 d組，每組均6只。利用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法制作大鼠VD模型，1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，行頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，腹腔注射硝普鈉(2.5 mg/kg)，無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈10 min后，再通10 min，再夾閉10 min，再通后縫合傷口。假手術(shù)組僅分離動脈，不阻斷血管，余同手術(shù)組。訓(xùn)練組給予穿梭箱訓(xùn)練，bFGF組腹腔注射bFGF，此后分別于3、7、14、21 d后處死取材，常規(guī)HE染色。

1.2 穿梭箱訓(xùn)練 以聲音為條件刺激，電擊為非條件刺激。先將大鼠放入穿梭箱內(nèi)暗適應(yīng)5 min，然后持續(xù)聲音刺激5 s，如大鼠不逃到另一端(穿梭)，則給予電擊，電流強(qiáng)度10～20 mA，使動物逃至箱底不通電一側(cè)，此時(shí)電擊停止，否則持續(xù)受電擊5 s。間隔30 s，開始下一輪訓(xùn)練。于造模后行穿梭箱訓(xùn)練，每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行20次聲、電刺激。

1.3 給藥方法 bFGF為北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司研制，用注射用水稀釋，bFGF組腹腔注射10 μg/kg，其余組腹腔注射等量生理鹽水，缺血后即刻給藥。

1.4 行為學(xué)評分 各組大鼠麻醉清醒后進(jìn)行模型篩選，造模成功大鼠分別進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，評分參照Zea Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)：0分：沒有神經(jīng)功能缺損；1分：左前爪不能完全伸展；2分：行走時(shí)，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒；4分：不能自發(fā)行走，有意識喪失。評分為0分和4分者均被剔除，隨機(jī)補(bǔ)充，保證每亞組6只不變。

1.5 腦梗死體積測定 各組大鼠于再灌注后3 d迅速斷頭取腦，置-70℃冰箱速凍10 min，取其前腦從額極到枕極切成2 mm厚的冠狀面腦片，將切片立即置于2%TTC磷酸緩沖液中避光、37℃恒溫孵育30 min，取出置于4%多聚甲醛中固定2 h。正常腦組織被染成鮮紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色。將固定的腦片按切片順序排列。數(shù)碼相機(jī)拍照后，應(yīng)用metamorph-evolution MP5.0顯微圖像分析系統(tǒng)測量前腦總面積和腦梗死面積，根據(jù)公式V=t(A1+A2+A3+……+An)-t(A1+An)算出前腦總體積和梗死體積。其中t為切片厚度，A為梗死面積。

1.6 NDRG1的免疫組織化學(xué)檢測 取各組缺血腦片厚約3 mm，浸入4%多聚甲醛固定液中，24 h后應(yīng)用免疫組織化學(xué)顯色檢測缺血海馬NDRG1的表達(dá)情況。滴加正常山羊血清37℃，30 min，分別滴加一抗兔抗鼠NDRG1 4℃過夜，滴加二抗37℃，60 min，滴加ABC復(fù)合液37℃，60 min，DAB顯色15 min，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。隨機(jī)選取每組4張切片，光學(xué)顯微鏡下觀察NDRG1免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞切片，每張切片再隨機(jī)選取3個(gè)視野，metamorph-evolution MP5.0顯微圖像分析系統(tǒng)檢測光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死體積比較 假手術(shù)組未見梗死灶。和模型組相比，訓(xùn)練組、bFGF組梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。訓(xùn)練組和bFGF組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別前腦總體積梗死灶體積梗死灶與前腦體積比模型組662.26±34.29148.16±22.3522.37%訓(xùn)練組652.21±36.421)116.34±13.431)17.83%1)bFGF組666.24±31.311)89.25±23.721)13.39%1)

與模型組比較：1)P<0.05

2.2 HE染色評估組織學(xué)改變 假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)完整；模型組細(xì)胞腫脹，分布不均，細(xì)胞周圍間隙增寬，有的細(xì)胞體積縮小，核固縮深染，其中3 d組織變化最為明顯；訓(xùn)練組和bFGF組海馬存活神經(jīng)元數(shù)比模型組增多，神經(jīng)元胞體腫脹明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，見圖1。

2.3 穿梭箱訓(xùn)練對NDRG1的影響 假手術(shù)組海馬NDRG1有輕度表達(dá)，隨缺血再灌注時(shí)間的延長，表達(dá)逐漸增加，高峰出現(xiàn)在21 d，之后其水平隨恢復(fù)時(shí)間有下降(P<0.05) 。訓(xùn)練組和bFGF組，NDRG1陽性產(chǎn)物表達(dá)較3、7、14和21 d 模型組海馬明顯增加，表達(dá)趨勢與模型組相同(P<0.05)，見表2，圖1。

組別3d7d14d21d假手術(shù)組0.204±0.0240.205±0.0140.203±0.0180.204±0.022模型組0.223±0.0111)0.236±0.0121)0.247±0.0261)0.261±0.0141)訓(xùn)練組0.293±0.0322)0.305±0.0412)0.316±0.0272)0.334±0.0222)bFGF組0.296±0.0212)0.309±0.0322)0.319±0.0182)0.338±0.0192)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

A：模型3 d組 HE染色；B：訓(xùn)練3 d組 HE染色；C：模型14 d組NDRG1陽性細(xì)胞；D：訓(xùn)練14 d組NDRG1陽性細(xì)胞；E：模型21 d組NDRG1陽性細(xì)胞；F：訓(xùn)練21 d組NDRG1陽性細(xì)胞圖1 VD大鼠海馬HE染色及NDRG1陽性細(xì)胞(×400)

3 討 論

成年大鼠海馬是重要的神經(jīng)生發(fā)區(qū)，為腦缺血后內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)參與修復(fù)奠定了研究基礎(chǔ)。內(nèi)源性 NSCs 通過增殖、遷移、分化過程參與腦缺血大鼠的神經(jīng)功能修復(fù)。本研究觀察了缺血后海馬 NSCs 的發(fā)生以及行為訓(xùn)練對其生發(fā)規(guī)律的影響，為腦缺血疾病的神經(jīng)康復(fù)提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)〔10〕。行為學(xué)訓(xùn)練是康復(fù)訓(xùn)練的一種，它主要訓(xùn)練動物的本能行為能力，如學(xué)習(xí)、記憶、空間辨別及覓食等，促進(jìn)受損的行為學(xué)功能的恢復(fù)。在本研究中，我們選用穿梭箱進(jìn)行訓(xùn)練，因?yàn)閂D大鼠的損傷區(qū)位于海馬區(qū)，而穿梭箱被證實(shí)是學(xué)習(xí)記憶能力最好的訓(xùn)練工具。既往在此模型基礎(chǔ)上的一系列研究表明，缺血性腦損傷大鼠經(jīng)過穿梭箱訓(xùn)練后，其受損的學(xué)習(xí)記憶明顯得到恢復(fù)，但訓(xùn)練作用的具體機(jī)制尚不十分清楚〔11，12〕。

有研究顯示，NDRG1與熱休克蛋白(Hsp)70及Hsp90相互作用，發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。研究人員發(fā)現(xiàn)NDRG1在新生小鼠的腎及腦中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，NDRG1蛋白表達(dá)濃度在小鼠出生后15 d由腎近曲小管逐漸移向集合管，而在腦組織中于同期從海馬錐體神經(jīng)元轉(zhuǎn)移到大腦灰質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，提示NDRG1參與了腎和腦的發(fā)育〔13〕。此外，有學(xué)者觀察缺乏NDRG1小鼠的機(jī)體變化，發(fā)現(xiàn)約5 w時(shí)，小鼠的坐骨神經(jīng)由于脫髓鞘萎縮，表現(xiàn)出肌無力，尤其后肢無力，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)是由于NDRG1缺乏導(dǎo)致施萬細(xì)胞功能障礙所致〔8〕。NDRG1在人體許多組織中均有表達(dá)，這提示可能參與了機(jī)體多種組織的生長發(fā)育〔14，15〕。本研究說明訓(xùn)練組和bFGF組對VD大鼠腦損傷具有修復(fù)作用，從一個(gè)側(cè)面揭示穿梭箱訓(xùn)練對NSCs增殖分化的作用機(jī)制。

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〔2015-09-14修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

遼寧省科技廳科學(xué)技術(shù)計(jì)劃資助項(xiàng)目(201602729)

呂威力(1974-)，女，副教授，博士，主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究。

邢雪松(1973-)，男，副教授，博士，主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)01-0020-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.008

1 病理學(xué)教研室 2 信息技術(shù)中心計(jì)算機(jī)教研室