Cbl-b基因介導T細胞免疫殺傷小鼠LA795肺腺癌細胞的實驗研究

黃海濤 張華

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Cbl-b基因介導T細胞免疫殺傷小鼠LA795肺腺癌細胞的實驗研究

黃海濤1張華2

目的 利用特異性小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默T細胞Cbl-b基因表達，觀察轉染T細胞對小鼠肺腺癌細胞LA795的體外免疫殺傷作用。方法 篩選高效特異性沉默Cbl-b基因的siRNA序列轉染T739小鼠脾臟T細胞，轉染72h后，利用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測IL-2、INF-γ等T細胞免疫因子分泌情況，比較單純T細胞、陰性對照T細胞及轉染T細胞與小鼠肺腺癌細胞LA795混合培養腫瘤殺傷率。結果轉染72h后，轉染組細胞因子IL-2、INF-γ分泌水平較空轉組和空白組顯著增加。在體外實驗中，與單純T細胞及陰性對照T細胞相比，轉染T細胞能更高效殺傷小鼠肺腺癌細胞LA795，最高殺瘤率達到58.38±3.82%。結論 利用特異性siRNA技術沉默Cbl-b基因能夠促進小鼠T細胞因子IL-2和INF-γ分泌，增強T細胞對肺腺癌細胞LA795的體外免疫殺傷作用。

Cbl-b；基因沉默；T淋巴細胞；肺腺癌；免疫療法

肺癌是臨床上最常見惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居男性惡性腫瘤首位，女性惡性腫瘤第二位[1]。肺腺癌屬于非小細胞癌，多數起源于支氣管黏膜上皮，晚期肺腺癌通過淋巴及血液等途徑全身多處轉移，多數已不適合手術切除，且放化療不能顯著提高肺癌總體生存期，耐藥現象普遍，難以得到持久緩解，患者遠期預后差[2]。與其他腫瘤類似，肺癌發生發展與機體免疫系統功能密切相關，發病個體均存在有不同程度的抗腫瘤免疫缺陷。研究發現，約30%-50%非小細胞肺癌表達黑色素瘤抗原MAGE-A3，肺癌組織內細胞毒性T淋巴細胞對腫瘤組織的滲透活性明顯減弱，免疫抑制細胞活性增強，腫瘤局部微環境處于免疫抑制狀態[3]。已有多種相關臨床試驗表明，非小細胞肺癌患者給予CTLA-4單克隆抗體或黑色素瘤抗原MAGE-A3疫苗治療，可有效激活體內T淋巴細胞抗腫瘤免疫，其總體生存期和無進展生存期均優于安慰劑組，且機體耐受良好[4-5]。Cbl-b蛋白是近年來發現的一種E3泛素鏈接酶，與T細胞活化和免疫耐受直接相關，可負性調節T細胞活化信號轉導通路，誘導機體對腫瘤免疫耐受[6]。已有動物實驗研究表明，Cbl-b基因敲除小鼠能在缺失CD28協同刺激分子的情況下，直接活化T細胞，促進細胞因子IL-2, IL-17和IFN-γ分泌，顯著增強機體抗腫瘤免疫活性[7-8]。國內有學者實驗結果表明，利用小干擾RNA技術沉默Cbl-b基因能顯著增強C57小鼠脾臟T淋巴細胞免疫活性[9]，這為以Cbl-b為靶向進一步免疫治療腫瘤提供了良好的思路。在本實驗中，我們同樣利用小干擾RNA技術沉默Cbl-b基因表達，體外觀察轉染并沉默Cbl-b基因后，T細胞對小鼠肺腺癌細胞LA795的免疫殺傷作用。

資料與方法

一、實驗動物與細胞

T739小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司，SPF級，4-6周齡，體重約15-20g。利用小鼠T細胞富集磁珠(BD Biosciences，USA)分離T739小鼠脾臟T細胞，T細胞純度能達到94.27%，培養基成分：90%1640培養基+10%胎牛血清+5μg/mL刀豆蛋白+1%雙抗。小鼠肺腺癌細胞LA795來源于T739近交系小鼠自發乳頭型肺腺癌，購于上海中國科學院細胞庫，培養基成分：90%1640培養基+10%胎牛血清+1%雙抗。

二、Cbl-b siRNA設計與合成

進入pubmed檢索界面，查詢T739小鼠Cblb-mRNA序列，利用siRNA在線設計軟件(siRNA Target Finder)篩選針對Cbl-b基因的4條潛在siRNA靶序列，具體如下：siRNA-1(有義鏈) 5-ACGCAAGCUUCAGUUGAAAtt-3’，(模板鏈)5’-UUUCAACUGAAGCUUGCGUtt-3’；siRNA-2(有義鏈)5’-GCGAUAUUUAACCGGAUUAtt-3’，(模板鏈)5’-UAAUCCGGUUAAA UAUCGCtt-3’；siRNA-3(有義鏈)5’-GCAUAUCAUUGCCAUAAUAtt-3’，(模板鏈)5’-UAUUAUGGCAAUGAUAUGCtt-3’；siRNA-4(有義鏈)5’-AGAGAGGCCCUGAUAUUACtt-3’，(模板鏈)5’-GUAAUAUCAGGGCCUCUCUtt-3’。上述siRNA序列均由上海吉凱基因技術有限公司設計并合成。

三、siRNA轉染T淋巴細胞

原代T細胞接種于6孔板中，當細胞融合度達到90%后，用PBS緩沖液清洗3遍，Opti-MEM培養基輕柔吹打并重懸，按照細胞密度為1-2×105個/mL接種于48孔板，每孔200μL。設置轉染組、空轉組、空白組共3組，其中轉染組將4條合成siRNA序列和LipofectamineTM 2000脂質體分別溶于20μL opti-MEM培養基中，siRNA和LipofectamineTM 2000脂質體含量分別為3μL和1μL，總體積終濃度為100nmoL/L，放置于室溫中10min。10min后，輕柔混勻，共同孵育25min，然后將轉染混合物加入48孔板T細胞懸液中，置于37℃條件下孵育6-8h，最后加入60μL胎牛血清繼續培養?？辙D組中每孔則加入上述等體積LipofectamineTM 2000脂質體和陰性對照siRNA序列，空白組則僅加入等量opti-MEM培養基，其余處理同轉染組。

四、Western blot檢測Cbl-b蛋白表達水平

依照上述方法轉染T細胞后繼續培養48h后收集細胞，1500rpm離心5min，予以生理鹽水清洗2遍，全蛋白提取試劑盒提取各分組T細胞總蛋白，lowry法測定總蛋白濃度，取蛋白樣品30-50μg對各分組Cbl-b蛋白表達量進行檢測和對比，轉PVDF膜80V 60min后，TBST稀釋的5%BSA在37℃中封閉1h，加入兔抗小鼠單克隆Cbl-b抗體(1：800稀釋)4℃孵育過夜，加入HRP標記羊抗兔單克隆二抗(l：1000稀釋)室溫孵育45min，定影顯色在ECL顯色系統中完成，觀察和分析雜交條帶。

五、ELISA檢測IL-2、INF-γ分泌變化

轉染72h后，收集上述各分組T細胞上清液，酶標板中分別加入標準品、稀釋液和待測樣品，每孔100μL，每組設3個復孔。37℃培養箱中反應2h，加入100μL生物素抗小鼠細胞因子IL-2、INF-γ抗體工作液，37℃溫度培養箱中避光孵育1h。加入親和素過氧化物酶復合物的ELISA工作液100μL，37℃避光孵育30min。每孔加入50μL TMB顯色液，37℃避光孵育30min，加入100μL終止液，450nm波長，酶標儀測定各孔平均光密度值(OD值)。

六、腫瘤殺傷率測定

轉染T細胞24h后，將轉染組、空轉組、空白組T細胞分別與小鼠LA795肺腺癌細胞共培養，效靶比分別設置為40:1、20:1、10:1，接種于96孔板，每組各設置3個復孔，體積各為100μL。另外，將單純T細胞和單純LA795肺腺癌細胞作為殺傷細胞組和目標細胞組，每孔100μL。細胞共培養72h后，CCK-8試劑盒測定和統計分析各分組T細胞腫瘤殺傷率。腫瘤殺傷效率計算公式如下：

腫瘤細胞殺傷率(%)=((ODE+ODT)-ODE+T)/ODT×100%

ODE+t=殺傷細胞+目標細胞孔OD值

ODE=單獨殺傷細胞的OD值

ODt=單獨目標細胞的OD值

七、統計學分析

結 果

一、轉染T細胞Cbl-b蛋白表達

T細胞轉染48h后，Western blot檢測各分組Cbl-b蛋白表達水平，4條siRNA序列對Cbl-b蛋白表達的抑制效率分別為81%、53%、27%、16%，而空轉組與空白組間無統計學差異，其中siRNA-1序列在蛋白水平抑制效率最高，達到81%，這表明設計合成的siRNA-1序列能在蛋白水平高效并特異性抑制LA795肺腺癌細胞Cbl-b表達(見圖1)，可用于后續實驗。

圖1 不同siRNA組Cbl-b蛋白表達

二、T細胞因子IL-2、INF-γ分泌水平

轉染T細胞72h后，利用ELISA法檢測各分組細胞上清液中細胞因子IL-2和INF-γ分泌水平，與空轉組和空白組相比，轉染組IL-2水平顯著升高(*P<0.001), 轉染組INF-γ水平有一定程度增加(**P=0.0014)，上述差異均具有統計學意義(見圖2)。

三、沉默Cbl-b基因增強T細胞對LA795細胞免疫殺傷能力

轉染T細胞與LA795肺腺癌細胞共同培養72h后，轉染組T細胞殺瘤活性較空轉組及空白組T細胞增加，差異具有統計學意義(*P=0.033,**P=0.024,***P=0.025)，值得注意的是，T細胞對LA795肺腺癌細胞殺傷率與細胞靶效比呈線性關系，即T細胞對LA795肺腺癌細胞殺傷率隨著靶效比升高而隨之增加，轉染組T細胞的腫瘤殺傷效率在效靶比為40:1時達到最高，為58.38±3.82%(見圖3)。

圖2 轉染48h細胞因子分泌變化

圖3 共同培養72h后測定腫瘤殺傷效率(%)

討 論

機體免疫功能低下與腫瘤發生發展密切相關，通過活化免疫細胞或免疫系統來抗腫瘤免疫治療，一方面能刺激T細胞增殖活化殺滅腫瘤細胞，另一方面能促進機體產生對腫瘤細胞的免疫記憶和免疫監視能力，從而防止腫瘤復發[10]。肺癌病理機制與機體免疫密切相關，已有研究表明肺癌細胞表面I類人白細胞抗原(HLA-I)的表達降低或者缺失，致其不能被樹突狀細胞有效識別[11]。另外，肺癌細胞能主動分泌TGF-β、PGE2、IL-10、COX-2及Toll樣受體等免疫抑制因子誘導機體免疫耐受[12]。T細胞通過介導細胞免疫直接殺傷腫瘤細胞，在機體抗腫瘤免疫過程中扮演關鍵作用[13]，而Cbl-b蛋白在T細胞活化和增殖過程中均起著重要的負性調節作用。研究表明Cbl-b基因敲除的 CD+4和CD+8T淋巴細胞均能在相當程度上抵消CD+4CD+25調節性T細胞和TGF-β介導的免疫抑制作用[14-15]。因此，Cbl-b蛋白的免疫負性調控作用為免疫激活T細胞治療晚期肺腺癌提供了可能。

在本實驗中，我們首先在各分組中加入CD3單克隆抗體,后者能特異地識別T細胞表面TCR/CD3復合體，刺激活化T細胞第一信號，而小干擾RNA沉默Cbl-b基因表達后發現T淋巴細胞的活化無須共刺激分子輔助，轉染組T細胞因子分泌水平顯著增加。細胞因子是由機體免疫細胞分泌的一種能調節細胞功能的小分子多肽，能激活人體抗腫瘤免疫功能，進而參與殺滅和控制腫瘤細胞。實驗結果表明，轉染T細胞72h后，細胞上清液中細胞因子IL-2和INF-γ分泌水平較空轉組和空白組均顯著升高，這表明沉默Cbl-b基因表達能促進T細胞活化。在體外免疫殺傷實驗中，我們觀察到siRNA沉默Cbl-b基因能增強T細胞對于肺腺癌細胞LA795的免疫殺傷作用，且殺傷力與靶效比存在正相關?；罨腡細胞能識別腫瘤細胞表面腫瘤抗原肽，并通過死亡受體FasL/Fas介導腫瘤細胞凋亡、顆粒酶/穿孔素殺傷等多種途徑清除腫瘤細胞。轉染T細胞與靶細胞LA795肺腺癌細胞混合培養72h，在10:1、20:1、40:1的不同靶效比水平，轉染組T細胞腫瘤殺傷率均比空轉組和空白組T細胞高。當效靶比為40:1時，殺傷力最強，達到58.38±3.82%，這表明通過特異性小干擾RNA技術沉默T細胞Cbl-b基因表達以增強其對于肺腺癌細胞LA795的細胞殺傷作用是可以實現的，但是這種體外實驗結果需要在動物實驗中予以進一步證實。

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The experimental research about immunity killing of Cbl-b gene mediated T lymphocyte against Mouse LA795 lung neoplasms cells

HUANGHai-tao,ZHANGHua

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFifthPeople'sHospitalofChengdu,Chengdu,Sichuan611130,China

Objective To investigate the cytotoxicity activity of transfected T lymphocytes against LA795 lung neoplasms cells in vitro by utilizing specific small interfering RNA (siRNA) to silence the expression of casitas B cell lymphoma-b(Cbl-b) gene of T-Lymphocytes. Methods T lymphocytes were transfected by specific siRNA to silence the expression of casitas B cell lymphoma-b (Cbl-b) gene. 72 hours after transfection, the secretion of IL-2 and IFN-γ were measured by ELISA. In the end, the cytotoxicity activity changes against LA795 lung neoplasms cells were compared among transfected T lymphocytes, negative control and blank control in vitro. Results 72 hours after transfection, compared with the other groups, T lymphocytes transfected with siRNA showed higher secretion level of IL-2 and IFN-γ (P<0.05). Transfected T lymphocyte also showed more efficient killing ability against LA795 lung neoplasms cells than negative control and blank control in vitro. The highest killing rate reached 58.38±3.82%. Conclusion Silencing Cbl-b can significantly promote the secretion level of IL-2 and IFN-γ of mice T lymphocyte, and enhance the cytotoxicity activity of T lymphocyte against LA795 lung neoplasms cellsinvitro.

Cbl-b; gene silencing; T-Lymphocytes; lung neoplasms; adoptive immunotherapy

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.03.043

611130 四川 成都，成都市第五人民醫院1.呼吸內科、2.消化內科

2016-06-22]