鹽酸氨溴索對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織細胞凋亡和血清炎癥因子的影響

陳曉明 張偉兵 田曉彥 劉長萍 張慧 趙春雨

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鹽酸氨溴索對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織細胞凋亡和血清炎癥因子的影響

陳曉明1張偉兵1田曉彥1劉長萍2張慧1趙春雨1

目的 研究細胞凋亡在大鼠慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)形成過程中的作用機制，并探討鹽酸氨溴索對慢阻肺大鼠肺組織細胞凋亡和血清炎癥因子的影響。方法 34只健康SD大鼠隨機分為3組：A正常對照組、B鹽酸氨溴索組、C模型組。采用免疫組化法檢測Bcl-2(b cell lymphoma/lewkmia-2)蛋白、Bax(Bcl-2 associated x protein)蛋白及Caspase-3蛋白的表達；采用血清酶聯免疫吸附測定法測定各組血清中炎癥因子(LTB4、IL-8、SP-D)的濃度。結果 與A組比較，C組中Bax蛋白、Caspase-3蛋白以及炎癥因子表達增多，Bcl-2蛋白的表達及Bcl-2/Bax減少，差異均顯著(P<0.05)；與C組比較，B組Bax蛋白、Caspase-3蛋白以及炎癥因子表達減少，Bcl-2蛋白的表達及Bcl-2/Bax增高，差異均顯著(P<0.05)。結論 慢阻肺的發病機制可能與細胞凋亡有關，鹽酸氨溴索在慢阻肺肺組織中發揮抗細胞凋亡和抗炎作用，其機制可能在于調控死亡信號通路中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達以及抑制炎癥因子的表達，起到肺保護的作用。

慢性阻塞性肺疾病；細胞凋亡；炎癥因子；鹽酸氨溴索

目前，慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)的發病機制尚不十分清楚，除了肺部的慢性炎癥、蛋白酶失衡、氧化與抗氧化失衡等在慢阻肺發病中起重要作用以外，越來越多的研究表明，細胞凋亡是慢阻肺形成與發展的重要機制，并且與Bcl-2、Bax、Caspase-3等細胞凋亡相關因子有關[1-2]。鹽酸氨溴索有促進肺泡表面活性物質生成、促進排痰和抑制炎癥反應的作用，并廣泛應用于臨床治療中，近期有少量研究顯示鹽酸氨溴索可調節凋亡蛋白的表達[3-5]，但尚需大量實驗驗證。

本實驗意在探究細胞凋亡在大鼠慢阻肺形成過程中的作用，并初步探討鹽酸氨溴索對慢阻肺大鼠肺組織細胞凋亡和血清炎癥因子的影響，指導其在臨床應用。

資料與方法

一、實驗動物和主要試劑

34只雄性、清潔級SD大鼠作為本實驗研究對象，鼠齡8周，體重(200±10)g，購于青島市實驗動物和動物實驗中心；鹽酸氨溴索購于德國勃林格殷格翰公司；LTB4、IL-8、SP-D試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司；Bcl-2、Bax、Caspase-3單克隆抗體均購自武漢博士德公司。

二、方法

1 大鼠慢阻肺模型的建立及分組:SD大鼠34只，隨機分為3組，A組10只，B組12只，C組12只。常規飼養1周，同時將各組大鼠按隨機數字表法標號，A組為正常對照組，B組為鹽酸氨溴索組，C組為模型組。大鼠正常飼養1周后開始建模。A組室溫下正常飼養，將B、C組大鼠從第8天到第63天(共8周)用哈爾濱煙(焦油10mg，CO 12mg，煙氣煙堿量0.8mg)煙熏，建立慢阻肺模型。C組大鼠于煙熏第8周開始皮下注射鹽酸氨溴索(沐舒坦)，30mg/次，2次/天，持續7天，第64天實驗停止，處死大鼠并取材。B、C組大鼠中分別有1只在實驗開始第10、11天死亡，B組中有1只大鼠在采血過程中出現差錯，血樣本不合格，故棄用。所以，最終進入實驗用于研究的大鼠分別為A組10只，B組10只，C組11只。

2 HE染色

① 經4%多聚甲醛固定的肺組織，常規脫水、石蠟包埋，4μm切片，每塊肺組織切5片。②肺組織的脫蠟使用二甲苯，經水化處理，各放置在二甲苯I液體中10min、二甲苯II溶液中10min；再分別放入無水乙醇I、II液體中浸泡10min，最后，染色前分別經95%、90%乙醇溶液浸泡5min后取出。③把經切片、脫蠟處理完畢后組織放置在蘇木素中先染色5min，之后，反復自來水沖洗5min。④ 1%鹽酸乙醇分別浸泡5秒。⑤ 于伊紅溶液中染色約20秒，水洗5min。⑥ 常規脫水，透明，封片：80%乙醇反應2min→95%乙醇I、II反應各5min→無水乙醇I、II反應各5min→二甲苯I、II反應各5min透明；經上述處理完畢后進行封片，使用中性樹膠，自然烘干待用于觀察和圖片采集。⑦ 由病理科進行圖片采集和分析。

3 免疫組化法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達:將石蠟切片常規脫蠟至水，3%H2O2去離子水孵育10min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗三次，每次2min。將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液中，一同放入微波爐內加熱4min，關閉電源10min，再加熱4min，取出，自然冷卻至室溫。滴加按1 ∶100比例稀釋的兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體，4℃冰箱中過夜，PBS沖洗三次，每次2min。滴加二抗，37℃孵育30min，PBS沖洗三次，每次2min。應用DAB顯色10min，蒸餾水充分沖洗。復染，將這組玻片浸入蘇木素染液中1min。脫水及透明處理。封片，將中性樹膠滴到玻片上，蓋上蓋玻片，稍待干，顯微鏡下觀察。Bax、Caspase-3檢測操作步驟同Bcl-2。結果分析：Motic3000顯微攝影系統于400倍下攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統對陽性表達進行定量分析，以積分光密度(IOD)代表基因和蛋白相對表達量，積分光密度(IOD)=陽性面積×平均光密度，每例隨機分析3個高倍鏡視野，取其均值代表該例的相對表達量。染色結果細胞核呈藍色，陽性為黃色或黃棕色。

4 ELISA檢測LTB4、IL-8和SP-D濃度:應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中LTB4、IL-8和SP-D的濃度。

IL-8和SP-D檢測操作步驟同LTB4。

三、統計學處理

結 果

一、各組大鼠肺組織病理學變化

所有標本經制片后在光學顯微鏡下(×100倍)顯示：A組大鼠肺泡大小一致，結構完整，未見氣腫樣改變，無炎癥細胞浸潤(圖1A)；B組肺組織鏡下特點為：局部肺泡擴張、融合，纖毛上皮細胞部分脫落，可見纖毛粘連、倒伏、甚至壞死，可見少量炎性細胞浸入，但是肺泡融合程度、炎性細胞浸潤和肺泡間隔斷裂等方面較C組減輕，但與A組比較，仍呈慢阻肺的肺組織病理學特點(圖1B)；C組肺泡結構明顯擴張，肺泡間隔融合、斷裂，肺大皰形成，伴隨有大量炎性細胞入侵，使纖毛上皮破壞、脫落，說明已成功建立慢阻肺(圖1C)

二、各組大鼠肺組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的變化

Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白均表達于胞質，在各組肺組織中都有少量表達，但C組Bax、Caspase-3蛋白的表達均明顯高于A組，Bcl-2蛋白的表達及Bcl-2/Bax值均明顯低于A組(均P<0.05)。進一步比較B、C兩組，C組Bax、Caspase-3蛋白的表達均明顯高于B組，Bcl-2蛋白的表達及Bcl-2/Bax值均明顯低于B組，均P<0.05(見表1，圖2)。

三、各組大鼠血清炎癥因子濃度比較

比較各組大鼠血清中炎癥因子，三組間LTB4、IL-8、SP-D血清濃度具有顯著差異，進一步比較A、C兩組，C組LTB4、IL-8、SP-D血清濃度明顯高于A組，比較B、C兩組，B組LTB4、IL-8、SP-D血清濃度明顯低于C組。表明慢阻肺大鼠血清中炎癥因子增多，經鹽酸氨溴索治療后，血清炎癥因子降低。(見表2)。

討 論

慢阻肺在全球范圍內發病率和病死率均較高，其死亡率呈逐年升高的趨勢，然而慢阻肺的早期癥狀輕微，不易引起重視，此外患者缺乏主動就診意識，導致其診斷率及治療率遠低于患病率[6]。實際上慢阻肺也是一種可防、可治的疾病，對慢阻肺患者早期發現并干預，有利于提高長期生存率。而早期發現依賴于早期正確的診斷，對其發病機制進行研究，有望做到早期診斷、合理治療，進而提高患者的生活質量，減輕社會經濟負擔。

目前，慢阻肺發病機制復雜，炎癥反應、蛋白酶與抗蛋白酶失衡、氧化應激、細胞凋亡在慢阻肺發病機制中起重要作用，其中炎癥因子增加及炎癥細胞凋亡減少是慢阻肺急性加重和病情進展的誘因，加之肺組織自身細胞的凋亡增加作為慢阻肺的致病因素越來越受重視。細胞凋亡與炎癥反應相互影響，相互促進，共同促進慢阻肺進展。

表1 各組大鼠肺組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量的積分光密度比較(IOD值，±s)

注：*與A組比較，P<0.05；#與C組比較，P<0.05

圖1 三組大鼠肺組織光鏡下病理學觀察(×100倍)

圖2 三組大鼠肺組織免疫組化染色情況(×400倍)

組別nLTB4IL?8SP?DA102343．21±120．98272．73±18．177．84±2．19B103216．40±270．59#519．77±17．20#10．89±1．74#C113747．89±153．13?665．24±21．25?14．02±1．28?

注：*與A組比較P<0.05，#與C組比較,P<0.05

Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡過程的重要成員，包括抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax等[7-8]。Bax與Bcl-2基因含有三個同源區域，即BH1、BH2、BH3，但兩者作用相反。Bcl-2、Bax等定位于線粒體膜上，Bcl-2阻止細胞色素C從線粒體釋放，從而抑制凋亡；Bax則相反，通過與線粒體膜結合，促進細胞色素C的釋放，進而促進細胞凋亡[9]。還有研究顯示，細胞對凋亡信號的敏感性取決于胞內Bcl-2/Bax競爭性的二聚體化過程。當Bcl-2基因高表達時，可形成Bcl-2/Bcl-2同源二聚體，也可形成Bcl-2/Bax異源二聚體，均抑制凋亡；而Bax表達升高時，則形成Bax/Bax同源二聚體，促進細胞凋亡[10-14]。

Caspase蛋白家族是細胞凋亡的核心成員，不同的凋亡刺激信號激活的Caspase不同，但Caspase-3是多種凋亡途徑的必經之路，是細胞凋亡的執行者。細胞凋亡通路主要有三個，即線粒體途徑、死亡受體途徑、內質網通路。線粒體途徑和死亡受體介導的信號轉導通路起關鍵作用。線粒體途徑又稱內源性途徑，經國內外不斷研究，目前認為該通路如下。凋亡信號如DNA損傷、氧化劑等可以引起線粒體損傷以及線粒體膜的滲透性改變，Bcl-2/Bax信號通路被啟動，進而刺激線粒體內膜間隙將細胞色素C釋放入胞漿。在此，細胞色素C結合apaf-1和Caspase-9的前體，使Caspase-9活化，后者激活Caspase-3，最終使DNA斷裂、破壞細胞骨架結構，最終導致細胞調亡[15]。位于細胞外的一些信號分子刺激細胞，與細胞表面的死亡受體結合，繼而激活細胞凋亡信號通路，導致細胞凋亡。哺乳動物細胞的死亡受體主要包括神經生長因子受體和腫瘤壞死因子受體超家族，主要成員有Fas/Apo-l/CD95，DR-4/TRAIL-R1等。當死亡受體Fas與配體FasL相結合后，Fas胞質區內的死亡結構域(death domain，DD)與Fas結合蛋白(FADD)結合，隨后，FADD以其氨基端的死亡效應結構域結合Caspase-8的前體，形成Fas-FADD-Caspase-8前體組成的死亡誘導復合物，激活Caspase-8，活化的Caspase-8可以進一步激活執行死亡功能的效應蛋白Caspase-3，導致細胞調亡[16]。Aoshiba[17]等人發現慢阻肺患者肺組織的Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細胞和血管內皮細胞中的DNA斷裂灶增多，并伴有活化的Caspase-3表達增多。與汪利華[18]、梁憲梅[19]等人的研究一致，同樣證實了Caspase-3是細胞凋亡的關鍵。所有這些表明，慢阻肺細胞通過各種途徑激活Caspase家族成員，引起DNA酶活化，誘發細胞凋亡。宋國棟[20]等人之后再次證實了Caspase-3是細胞凋亡過程的重要成員。

在本實驗研究中，經過煙霧處理后，B、C兩組HE染色均有不同程度的肺氣腫改變，表明慢阻肺造模成功。C組Bcl-2蛋白的表達明顯低于A組，而Bax、Caspase-3蛋白的表達明顯高于A組，尤其是Bcl-2/Bax下降，提示煙霧誘導的慢阻肺大鼠肺組織中已經發生了細胞凋亡，若及時阻止此過程，就會防止肺泡腔進一步擴大和肺組織重構進行性發展。所以，研究慢阻肺中凋亡機制具有較為重要的意義。

經鹽酸氨溴索干預后，B組Bax、Caspase-3蛋白的表達明顯少于C組，而Bcl-2蛋白的表達以及Bcl-2/Bax升高，差異具有統計學意義。表明B組大鼠肺組織的凋亡細胞少于C組，證實了鹽酸氨溴索有抗細胞凋亡的作用。加之Bcl-2保護蛋白的增多，進一步說明了鹽酸氨溴索具有肺保護的作用，延緩了慢阻肺的進展。

本實驗研究還發現血清LTB4、IL-8、SP-D炎癥因子在A組大鼠肺組織中升高，表明血清LTB4、IL-8、SP-D與香煙煙霧暴露下慢阻肺關系密切，炎癥因子是慢阻肺發生的重要因素。經鹽酸氨溴索治療1周后上述炎癥因子的表達有所下降，即B組小于C組，差異有統計學意義，說明鹽酸氨溴索在本實驗中亦發揮抗炎作用。

多年來，鹽酸氨溴索用于呼吸道疾病，如慢阻肺、肺感染、急性呼吸窘迫綜合征等，其藥理作用主要在于化痰。經多年研究顯示，鹽酸氨溴索還具有抗氧化、肺保護以及與抗生素的協同作用。有少量文獻報道鹽酸氨溴索有抗細胞凋亡作用，但研究多集中于腫瘤、急性肺損傷、缺血再灌注損傷等方面[3-5]，但是鹽酸氨溴索治療慢阻肺的作用是否也與抗細胞凋亡有關，尚未見文獻報道，本實驗證實了鹽酸氨溴索在慢阻肺的治療中與細胞凋亡有關，其機制可能在于調控Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達。本實驗還證實了單獨使用鹽酸氨溴索也有抗炎的作用，而不是必需要與抗生素聯合，為鹽酸氨溴索的臨床應用開拓了新思路。但是鹽酸氨溴索的眾多藥理作用，在慢阻肺治療中的作用程度有多大，哪一方面為主，尚需進行大量實驗研究。另外本實驗樣本量相對較小，結果可能具有局限性，需要大樣本實驗來證明結論、探討其具體機制。

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Influence of ambroxol on cell apoptosis in lung tissue and serum inflammatory factor in rats with chronic obstructive pulmonary disease

CHENXiao-ming,ZHANGWei-bing,TIANXiao-yan,LIUChang-ping,ZHANGHui,ZHAOChun-yu

theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,Heilongjiang150001,China

Objective To study the mechanism of action of cell apoptosis in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and to discuss the influence of ambroxol on cell apoptosis in lung tissue and serum inflammatory factors in rats with chronic obstructive pulmonary disease. Methods 34 healthy SD rats were randomly divided into three groups. The normal control group was named A, the ambroxol group was named B, and the COPD model group named C. The expressions of apoptosis markers (Bcl-2, Bax, Caspase-3) in each group were tested by immunohistochemistry, and the contents of the inflammatory factors (LTB4, IL-8, SP-D) in each group were tested by ELISA. Results Compared with the group A, the group C had higher expression of Bax, Caspase-3 and inflammatory factors, and lower expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax (P<0.05). Compared with the group C, the group B had lower expression of Bax, Caspase-3 and inflammatory factors, and higher expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax (P<0.05). Conclusion The mechanism of COPD may associate with cell apoptosis. The ambroxol has the effect of anti-apoptosis and anti-inflammatory, and it is probably that the ambroxol could regulate the expression of Bcl-2, Bax and Caspase-3 and inhibit the expression of inflammatory factors, and the protect lung.

chronic obstructive pulmonary disease; apoptosis; inflammatory factors; ambroxol

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.03.040

1.150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫科大學附屬第四醫院老年病二科 2. 150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱汽輪機廠職工醫院內一科

張偉兵，E-mail：weibingzhang6688@163.com

2016-06-16]