慢性阻塞性肺疾病患者外周血調節性T細胞和Foxp3的表達

郝璐 張園

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郝璐 張園

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，慢阻肺) 是一種主要由免疫反應所引起的以肺實質、氣道和肺血管為特征的疾病[1]，發展趨勢為進行性，和肺部對有害氣體或者有害顆粒等的異常炎癥反應存在密切聯系[2]，并與多種炎癥介質和細胞因子有關[1]。其臨床表現主要為肺氣腫、黏液分泌增加以及阻塞性細支氣管炎[3]。有研究表明，慢阻肺發病的關鍵機制可能同它自身的免疫系統調節紊亂有很大關聯[4]。并且，大量研究證實，慢阻肺患者的氣道、肺血管以及肺實質中均存有慢性炎癥[5]。慢阻肺的發展是包括巨噬細胞、中性粒細胞及T淋巴細胞等在內的多種炎性細胞參與的結果[6]。因此，對這些炎癥細胞在慢阻肺中具體作用機制的了解還是十分有必要的。

資料與方法

一、研究對象

采用前瞻性研究方法，選擇 2013 年6月至 2015 年 3月我院收住的 慢阻肺 患者 105例，其中男性 64 例，女性 41 例，年齡 31-74 歲，平均年齡(47.2±8.6)歲；另選取本院科研志愿者108例作對照組，其中男性64例，女性44例，年齡 32-68歲，平均年齡(48.9±6.7)歲。

診斷標準：參考 2010 慢阻肺 全球倡議及 2007年中華醫學會呼吸病學分會 慢阻肺 組制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中的診斷標準[12]：①慢阻肺 危險因素接觸史(可有)；②咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀(可有)；③存在不完全可逆的氣流受限：使用支氣管擴張劑后第1 秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)<70%，FEV1<0.8預計值(必須具備)。

病例納入標準：①符合 慢阻肺 診斷標準；②年齡 30- 80歲女或男患者；③患者表明接受臨床研究是自愿，并取得患者知情同意。病例排除標準：①肺大皰者、合并氣胸和有出血傾向患者；②結核、支氣管擴張、囊性肺纖維化、腫瘤、真菌感染、由過敏因素或刺激性氣體導致的慢性咳嗽、喘息病患；③其他疾病如泌尿、代謝、心血管、消化系統等嚴重并發病，肝腎功能不全，癡呆、意識不清與其他精神病病患；④影響運動呼吸功能的神經肌肉病患；⑤哺乳或妊娠期婦女。本研究經我院學術倫理委員會審批同意并獲得所有研究對象的知情同意，且每位受試者入選前已簽知情同意書。

二、肺功能的測定

早晨開始測定。使用200μg沙丁胺醇 (上海威智醫藥科技有限公司) 15min后，采用德國生產的Carefusion型肺功能儀(型號：234Gmbh)測定肺功能參數：用力肺活量 (forced vital capacity , FVC)、第1秒用力呼氣容積 (forced expiratory volume in one second , FEV1)、FEV1/FVC、最大呼氣流量 (peak expiratory flow, PEF)。各指標均以實測值占預計值百分比表示。

全部患者及對照組都在清晨空腹狀態下抽10mL外周靜脈血，其中的5mL用離心來分離出血清，在-70℃環境下保存用來進行細胞因子的檢測。另外5mL加入肝素抗凝，用淋巴細胞分離液 (AXIS-SHIELD公司)常規分離外周血單個核細胞(peripheral blood monouclear cells, PBMC)，使用含 有10%小牛血清的RPMI-1640溶液調整細胞濃度至1×106/mL，取200μL的細胞液，在其中分別加入20μL抗CD25-PE和抗CD4-FITC的單克隆抗體，同型對照為IgG1-FE和IgG1-FITC，混勻后，避光孵育25至30min，然后用PBS溶液洗滌2次。接著將細胞懸浮于0.5mL PBS緩沖液中，震蕩均勻后，應用EPICS-XL流式細胞儀(Becton Dickinson公司)進行檢測，檢測指標為各陽性細胞數量和所占比例。胎牛血清(FBS)和RPMI-1640培養基為美國GIBCO公司產品，抗CD4-FITC、抗CD25-PE、IgG1-FITC和IgG1-FE均為美國Becton Dickinson公司產品。

四、qPCR檢測

利用TRIZOL法常規提取PBMC總RNA[13]，各取2μg總RNA，按MBI逆轉錄試劑盒(Fermentas MBI, Sacramento,CA,USA))說明書操作，使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UGD (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進行PCR反應，總反應體積20μL。Foxp3正義鏈5′-TTTCATGCACCAGCTCTCAATCAA-3′，反義鏈5′-ATGGCACTCAGCTTCTCCTTCCTTC-3′，產物長度580bp；GADPH正義鏈5′-AATCCCATCACCATCTTCCATCCA-3′，反義鏈5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGCTTG-3′，產物長度475bp。PCR反應條件：95℃預變性3min，Foxp3 為45個PCR循環(95℃變性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸90s)72℃10min再延伸，GADPH為45個PCR循環72℃(95℃變性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸90s)72℃10min再延伸。定量PCR反應產物1.5%瓊脂糖凝膠上電泳30min(100V)，用GDS8000型全自動凝膠成像分析系統(英國UVP公司)進行掃描分析Foxp3基因相對表達水平采用2-ΔΔCt方法計算。

五、Western blot檢測

PBMC經PBS清洗，細胞溶解緩沖液溶解后，一抗是小鼠抗人β-actin抗體，二抗是HRP標記的羊抗鼠IgG，顯色后采用X光片曝光，然后通過掃描及ScnImage分析系統處理，目的蛋白的相對含量即是目的蛋白條帶的光密度值與β-actin條帶光密度值的比值。小鼠抗人β-actin抗體和羊抗鼠IgG抗體購自上海瑞齊生物科技有限公司。

六、細胞因子檢測

采用定量ELISA法測定上述預留血液的IL-4(interleukin 4)、IL-10(interleukin 10)、IFN-α(interferon-α)、IFN-γ(interferon-γ)、TGF-β(transforming growth factor-β)水平，操作嚴格按ELISA試劑盒(上海酶聯生物公司)的使用說明進行檢測。設空白對照，用酶標儀(Bio-tek instuments inc公司)在450 nm測定吸光值(A)，雙管檢測，去掉對照A值后取其平均值。

七、統計分析

結 果

一、一般資料

慢阻肺組FEV1與對照組比較顯著下降 (72.4±7.9vs98.1±8.3,P<0.01)，FEV1/ FVC與對照組比較顯著下降 (70.2±10.9vs97.5±15.2,P<0.01)。慢阻肺組與對照組在年齡、性別、吸煙史、FVC和PEF均無統計學差異，均P>0.0，(見表1)。

二、慢阻肺與對照組調節性T細胞亞群比較

表1 一般資料

FVC, forced vital capacity; FEV1, forced expiratory volume in one second; PEF, peak expiratory flow

表2 慢阻肺與對照組調節性T細胞亞群比較(±s, %)

圖1 流式細胞儀檢測結果

A：慢阻肺組流式細胞儀檢測結果；B：對照組流式細胞儀檢測結果. 注： IL-4, interleukin 4; IL-10, interleukin 10; IFN-α, interferon-α; IFN-γ, interferon-γ; TGF-β, transforming growth factor-β

三、慢阻肺組與對照組Foxp3 mRNA及蛋白表達差異

研究對象均采用全自動凝膠成像分析系統進行掃描分析，兩組組內的Foxp3表達條帶相似，因此最終我們分別選取了1例慢阻肺患者和1例對照的條帶作為示例進行比較，慢阻肺患者與對照人群PBMC中Foxp3 mRNA的表達結果(圖2A)，可見慢阻肺組條帶顯示較對照組淺。慢阻肺患者PBMC中Foxp3 mRNA表達水平與對照組比較顯著低于對照組 (0.42±0.15vs0.69±0.18,P<0.01) (圖2)。

所有研究對象western blot分析，兩組組內的Foxp3表達條帶很相似，因此最終我們分別選取了1例慢阻肺患者和1例對照的條帶作為示例進行比較，慢阻肺患者與對照人群PBMC中Foxp3 蛋白表達結果(見圖3A)?？梢妰山MPBMC中Foxp3蛋白的表達趨勢和Foxp3 mRNA是一致的，慢阻肺組條帶顯示較對照組淺。慢阻肺患者PBMC中Foxp3 蛋白表達水平與對照組比較顯著低于對照組 (0.29±0.09vs0.58±0.12,P<0.01) (圖3B)。

圖2 RT-PCR檢測兩組Foxp3 mRNA表達水平

注：圖A表示RT-PCR檢測兩組Foxp3 mRNA水平，其中1表示對照組；2表示慢阻肺組；圖B表示兩組Foxp3 mRNA表達水平比較

圖3 Western blot 檢測 兩組Foxp3 蛋白水平

注：圖A表示Western blot檢測兩組Foxp3 蛋白水平，其中1表示對照組；2表示慢阻肺組；圖B表示兩組Foxp3 蛋白表達水平比較

四、慢阻肺組與對照組血清細胞因子水平比較

慢阻肺患者血清IL-10濃度與對照組相比顯著降低 (31.53±9.05vs34.27±11.01,P<0.05)，血清TGF-β濃度與對照組相比顯著降低 (161.26±32.53vs175.38±41.19,P<0.05)。慢阻肺患者血清IL-4、IFN-γ濃度低于對照組，IFN-α濃度高于對照組，但差異無統計學意義 (表3)。

表3 兩組患者血清細胞因子水平比較

五、慢阻肺組Foxp3 mRNA和蛋白與肺功能指標和血清細胞因子水平的相關性

Foxp3 mRNA和蛋白與肺功能指標FEV1(%)和FEV1/FVC(%)呈一定的正相關 (P<0.05)，而與FVC(%)和PEF(%)無顯著相關性 (P>0.05)。Foxp3 mRNA和蛋白與血清細胞因子IL-4、IL-10、IFN-α、IFN-γ和TGF-β均呈一定的正相關 (P<0.05)。

表4 慢阻肺組Foxp3 mRNA和蛋白與肺功能指標和血清細胞因子水平的相關性

討 論

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HAOLu,ZHANGYuan

Departmentof

RespiratoryMedicine,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Huhhot,InnerMongolia010050,China

chronic obstructive pulmonary disease; pulmonary function; CD4+Treg; CD25+Treg; serum concentration; Foxp3

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.03.002

內蒙古自治區高等學?？茖W研究項目(No NJZC14135)

010050 內蒙古 呼和浩特，內蒙古醫科大學附屬醫院呼吸內科

張園，E-mail：zhangyuan160114@163.com

2016-06-14]