水中糞大腸菌群檢測方法的對比

何 敏，張亞娟，周艷紅，余沛芝，周 婷，董曉晨，趙賽君，鄒真妮，Yun Yunbo，劉洪波

(1.蘇州工業園區清源華衍水務有限公司水質檢測中心，江蘇蘇州 215021； 2.上海理工大學環境與建筑學院，上海 200093；3.亞琛工業大學水和固體廢物管理研究所, 德國亞琛 52056)

飲用水安全密切關系到社會文明建設和人民群眾身體健康，越來越受到政府和人民群眾的重視[1]。中國的飲用水和水源水的衛生學評價指標為(耐熱)糞大腸菌群[2]，它是評價水質的重要指標，具有廣泛的衛生學意義。水體中糞大腸菌群主要來自人畜糞便的污染，其對氯的抵抗力相似于腸道致病菌。該菌的檢測方法主要為多管發酵法和酶底物法等[3]。

多管發酵法是根據糞大腸菌群發酵乳糖、產酸產氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢菌來判定菌群，它是目前檢測糞大腸菌群的標準方法。多管發酵法有技術成本低、結果準確等優點，但可檢測時間長、試驗過程操作繁瑣和最后的試驗結果還需驗證等劣勢，使其不能快速檢測水體中的糞大腸菌群[4]。李永[5]曾評定多管發酵法檢測污水中的糞大腸菌群的結果不確定性，檢測過程不同陽性管的使用和試驗操作都可能為測定結果帶來很大的不確定性。古麗茹合薩熱·艾海提[6]提出，使用多管發酵法檢測糞大腸菌群時必須要保證培養基的質量，注重培養基的pH和高壓滅菌情況，說明該方法試驗過程要求高、操作繁瑣。

酶底物法是根據大腸菌群細菌能產生特異性的β-半乳糖酶，分解鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷ONPG的原底物，使培養液呈黃色[7]，指示水體中糞大腸菌的存在。唐慧穎[8]采用固定底物酶底物法，對瓶裝礦泉水、水廠取水口水、長江水、污水處理廠出水、城區河道水和畜禽養殖場出水中的糞大腸菌群，分別進行平行雙樣測定，相對偏差為0～12%，且在測定較清潔水樣中的糞大腸菌群時，具有較高的精密度。湯琳等[9]研究發現酶底物法在應急監測中檢測糞大腸菌群有很好的適用性。它還可在普通實驗室操作，快速檢測，無需驗證，能夠彌補多管發酵法的不足，但目前還未列入《水和廢水監測分析方法》中，需進一步驗證其可行性。本試驗是選用多管發酵法和酶底物法作對比，驗證酶底物法檢驗水樣的準確性及方便性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

試驗水樣分別采集于蘇州某自來水廠過程水、蘇州太湖水域水源水、蘇州某污水廠污水進、出水。按照無菌條件[10]采集水樣500 mL于滅菌的玻璃瓶中，置于4～8 ℃的冰箱中，2 h內送到實驗室進行檢測。

1.2 儀器設備與試劑

1.2.1 儀器設備

培養箱(上海一恒)、立式壓力蒸汽滅菌器(Yamato)、程控定量封口機(Biostron)等儀器。

1.2.2 試劑材料

試劑：乳糖蛋白胨、EC肉湯、伊紅美藍瓊脂(北京陸橋)、科立得Colilert-18等試劑。

材料：試管、試管架、90 mm培養皿、接種環、無菌采樣瓶、科立得97孔定量盤等用具。

1.3 試驗方法

多管發酵法。參考《生活飲用水標準檢驗方法》(GB/T 5750.12—2006)和《水和廢水監測分析方法》第四版增補版。將水樣分別接種到盛有乳糖膽鹽培養基的發酵管中。在37±0.5 ℃下培養24±2 h。產酸和產氣的發酵管說明試驗呈陽性，輕微震蕩后，用3 mm接種環將培養物轉接到EC肉湯培養液中，在44.5±0.5 ℃下培養24±2 h。

酶底物法。先在100 mL的水樣中加入科立得Colilert-18試劑，搖勻完全溶解后倒入科立得97孔定量盤中，在定量封口機過塑封裝。然后置于44.5±0.5 ℃培養箱中培養24 h進行結果判讀，如果產生可疑陽性，可延長時間至28 h，超過28 h后出現的顏色不作為陽性結果。

數據統計。數據整理統計方法使用excel和SPSS10.0軟件中的t檢驗。

2 結果與分析

2.1 質控標樣

本次試驗將認證的商售IDEXX-QC大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)和綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)分別作為陽性和陰性控制菌株，多管發酵法和酶底物法分別對其進行檢測分析，檢測結果如表1所示。由表1可知，兩種方法對陽性大腸埃希氏菌的測定數值均在置信范圍內，且均未檢測出陰性綠膿假單胞菌，可用于后面的試驗分析。

表1 質控標樣測定結果比較Tab.1 Comparison of Determination Results of Quality Control Standard Samples

2.2 較清潔水樣兩種方法結果比對

對60份水樣進行檢測，其中第1～20份是自來水廠過程水、21～40份是蘇州太湖水域水源水、41～60份是蘇州某污水廠加次氯酸鈉和紫外消毒處理后的出水，分別用多管發酵法和酶底物法進行檢測，結果如圖1、表2及表3所示。

圖1 較清潔水樣兩種方法結果比對Fig.1 Comparison Results between Two Methods for the Cleaner Water Samples

表2 較清潔水樣多管發酵法和酶底物法相關系數Tab.2 Correlation Coefficients of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for the Cleaner Water Samples

結果顯示，兩種方法的檢測數據變化大致相同。相關系數r=0.947，可看出兩組數據的相關性很好，P=0.000，說明兩組數據的相關性趨于一致[11]。對兩種方法的結果進行配對t檢驗，t=0.231，P=0.818(>0.05)，即差異沒有顯著意義?？烧J為酶底物法與多管發酵法沒有區別, 效果是相同的。腸桿菌屬要延遲發酵[12]，蘇州太湖水源水用多管發酵法時注意初發酵要延遲，文獻[13]是通過陽性管進行平板分離提取菌株總DNA作為模板，使用16S rRNA進行PCR擴增證實太湖源水腸桿菌屬中的陰溝腸桿菌延遲發酵，建議將多管發酵法測定總大腸菌群的乳糖發酵時間延長48 h，保證檢測結果會更準確。

表3 較清潔水樣多管發酵法和酶底物法配對t檢驗結果Tab.3 Paired t Test Results of Multiple Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for the Cleaner Water Samples

2.3 污水進水結果兩種方法比對

對30份污水進水水樣進行檢測，為了使結果影響因素少，多管發酵法和酶底物法選用200 000倍的稀釋倍數來稀釋水樣，結果如圖2、表4及表5所示。

結果顯示，r=0.602，表明兩種方法相關性較強，P=0.000，兩組數據的相關性趨于一致。對兩種方法的結果進行配對t檢驗，t=0.373，P=0.712(>0.05)，即兩種方法測定結果的差異沒有顯著意義，可認為兩種方法是等效的。但文獻表明[14]，酶底物法檢測水樣時，污水稀釋度越高，測定結果就越偏低。本試驗在檢測污水和清潔水樣的糞大腸菌對比中得出，污水水樣的結果偏低，所以在日常檢測糞大腸菌時，應準確掌握污水可稀釋的最小倍數，保證檢測結果準確。

圖2 污水進水水樣兩種方法結果比對Fig.2 Comparison Results of Two Methods for Wastewater Influent Water Samples

表4 污水進水多管發酵法和酶底物法相關系數Tab.4 Correlation Coefficient of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for Wastewater Influent

表5 污水進水多管發酵法和酶底物法配對t檢驗結果Tab.5 Paired t Test Results of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for Wastewater Influent

3 討論

通過配對t檢驗比較兩種方法檢測較清潔的水樣和污水廠進水中含不同糞大腸菌的濃度，從結果一致性的角度來看，多管發酵法和酶底物法無統計學意義上的顯著性差異。

表6為這兩種方法優缺點的比較。多管發酵法是一直沿用的方法，積累了很多年的經驗，對污水進水檢測還是很靈敏的，且數據可靠，但反應時間長、試驗過程繁瑣，若是不應急的水樣使用多管發酵法則可以獲得更準確的數據。

酶底物法用于檢測水樣中的糞大腸菌群是可靠的，相比于多管發酵法，它具有較多的優勢特點。美國、歐洲等國家選用酶底物法檢測自來水廠的糞大腸菌群，除此之外，應急水樣檢測也使用了該方法。

表6 多管發酵法和酶底物法的優缺點比較 Tab.6 Comparison of Advantages and Disadvantages of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method

4 結論

酶底物法特別適用于較清潔的水樣，它能夠快速、穩定地檢測出結果，尤其是應急水樣。本試驗中酶底物法置信度95%的差異說明檢測結果的一致性，但檢測污水水樣稀釋倍數越高，測定結果會有所降低，若污水稀釋倍數低，誤差不大時可被應用。酶底物法應當不斷改進優化，日后可作為評價水質微生物重要的檢測方法得以推廣。