表面等離子體共振譜儀用于糖蛋白檢測研究

王 金 美， 于 清 旭

( 大連理工大學 物理與光電工程學院, 遼寧 大連 116024 )

表面等離子體共振譜儀用于糖蛋白檢測研究

王 金 美， 于 清 旭*

( 大連理工大學 物理與光電工程學院, 遼寧 大連 116024 )

介紹了一種表面等離子體共振(SPR)生化分析儀，采用角度掃描與強度調制相結合的方法來實現對糖蛋白的實時監測．在糖蛋白的檢測實驗中，對不同pH的再生液進行對比，pH=3的再生能力達到97%，選擇該pH的溶液作為再生液；對同一濃度的糖蛋白進行5次測量，得出相對標準偏差(RSD)為3.83%；通過非糖蛋白與糖蛋白的對比實驗，說明本實驗方法可以對糖蛋白進行特異性檢測；最后對濃度在0.01～1 mg/mL的糖蛋白進行檢測，并進行了線性擬合和多項式擬合，通過殘差分析和相關系數的比較得出RNase B的濃度與歸一化光強的關系更符合多項式擬合，因此以多項式擬合曲線作為其標準曲線．實驗結果表明該SPR譜儀可以對糖蛋白進行特異性檢測，該技術將會在醫學方面得到廣泛應用．

表面等離子體共振(SPR)；實時監測；糖蛋白；硼酸

0 引 言

蛋白質的糖基化修飾廣泛地存在于生物體內，對自身免疫、老化、癌細胞異常增殖及轉移、病原體感染等過程起著重要作用[1-2]．糖蛋白翻譯后加工修飾異常與疾病密切關聯，因此對于異常糖蛋白檢測可以使疾病在早期發生時即可做出診斷[3-4]．目前糖蛋白的檢測主要有親和層析技術、質譜等，但是這些方法有一定不足，不能在短時間內獲得檢測結果，需要標記[5-6]．表面等離子體共振(SPR)技術由于具有能實時監測反應動態過程，分析樣品無須純化、無須標記，反應靈敏度高，無背景干擾[7-9]，尤其是在研究動力學系數方面的突出優點[10]，成為近幾年的研究熱點[11-13]，目前已經被廣泛應用到生物、化學、醫學、環境及食品安全等領域[14-15]，因此本文采用SPR技術檢測糖蛋白．

SPR是利用金屬薄膜耦合產生的一種物理光學現象．1902年，Wood在光學實驗中首次發現了SPR現象[16]；1968年Kretschmann等建立了Kretschmann結構，為SPR研究奠定了基礎[17]；1983年，Liedberg等首次提出將SPR技術運用到生化大分子檢測方面[18]；1990年，BiacoreAB公司生產出第一臺商業化SPR生化分析儀，此后SPR技術得到迅速發展．

實驗室已搭建的系統[19]采用角度掃描結構，該調制方法具有測量靈敏度高、簡單直觀、易觀測等優點，但實時性較差．本文提出角度掃描與強度調制相結合的檢測方法，以實現SPR譜儀對被測物的實時在線監測．由于光強檢測法容易受光源功率穩定性的影響，引入參考通道的方法來提高系統的穩定性．

1 原 理

1.1 SPR生物傳感原理

SPR利用了衰減全反射的原理，當入射光的平行偏振分量從棱鏡等光密介質入射到金屬等光疏介質的分界面處發生全反射現象時，將會產生消逝波，它將進入金屬薄膜內并激發金屬中的自由電子產生表面等離子體波．當表面等離子體波和消逝波沿界面方向的分量相同時，反射光的能量急劇衰減，這種現象就稱為表面等離子體共振[20]，發生表面等離子體共振時的入射角稱為SPR共振角．

SPR對被測物的折射率非常敏感，但是無修飾的SPR傳感器只與被測物的折射率有關，而與樣品種類無關[21]．SPR生物傳感器是先在金屬薄膜表面修飾一層自組裝單分子層，這層分子具有特異性識別的功能，只能吸附特定物質，這樣就實現了特異性檢測．

角度調制采用固定入射波長來進行角度掃描，通過掃描曲線得出共振角，此方法具有測量靈敏度高、易觀測等優點，因此被廣泛應用．在金屬薄膜上修飾了自組裝單分子層后的掃描曲線如圖1中的曲線1；被測物與修飾上的分子特異性結合引起金屬界面折射率的變化，從而引起共振角的變化，如圖1中的曲線2．角度掃描式檢測方法通過掃描曲線得出共振角，因此檢測速度較慢，不能很好地監測曲線的動態過程，實時性較差．強度調制是固定入射波長和入射角來進行光強監測的，因此檢測速度快，本文采用角度掃描與強度調制相結合的方法進行檢測，即固定入射角后檢測反射光強．固定入射角后定點監測是先利用角度調制的方法掃描出修飾了自組裝單分子層的曲線1，找出曲線共振峰左側斜率最大值，以此角度為入射角進行定點監測，得出動態曲線．

圖1 SPR檢測原理

1.2 糖蛋白檢測原理

在水溶液中，硼酸分子可以與含有順式二醇類的分子共價結合，形成五元環或六元環硼酸酯，如圖2所示．因此硼酸分子被廣泛應用于葡萄糖、糖蛋白等含有順式二醇類生物分子的識別中．硼酸分子與順式二醇類分子共價結合具有在堿性環境中穩定，而在酸性條件下可逆解離的特點．因此改變pH可以實現硼酸物質對含有順式二醇類生物分子可逆的解離[22]．

圖2 硼酸分子與順式二醇類化合物相互作用

利用以上性質，采用SPR技術檢測糖蛋白核糖核酸酶B(RNase B)．首先，含巰基的11-巰基十一烷酸(MA)與硼酸分子3-氨基苯硼酸(APB)利用羧基與氨基的縮合反應生成11-巰基十一烷酸-3-氨基苯硼酸(MA-APB)．利用金與末端含巰基的分子可以形成牢固Au—S鍵的性質[23]，鍍有金膜的傳感芯片在MA-APB溶液中浸泡12 h，就可以在金膜表面形成一層穩定的自組裝單分子層．這樣金膜末端連接了能特異性識別RNase B的APB分子，再將糖蛋白RNase B溶液通過流通系統通入傳感芯片，RNase B與APB特異性結合，SPR信號響應增強，實現實時快速檢測．

2 糖蛋白檢測實驗

2.1 實驗裝置

實驗裝置如圖3所示．He-Ne激光器發出激光，首先經過斬波器調制成某一特定頻率的方波，再經過反射鏡1進入分光棱鏡分成兩路，一路作為補償光路進入探測器2，一路通過反射鏡2進入圓柱棱鏡系統，產生SPR現象后的反射光進入探測器1．斬波器將調制的方波作為參考信號，信號通道和補償通道都經過探測器后作為兩個信號通道進入雙通道鎖相放大器，最后通過串口發送給計算機，利用LabVIEW上位機軟件顯示并保存數據．

圖3 SPR譜儀系統簡圖

進樣系統的主要部分是流通池，待測液從流通池的進液口進入，通過蠕動泵的輸送，從出液口排出到廢液缸中．

補償通道是通過加入分光棱鏡，再分出一路光直接連接到探測器2，實時測量激光器的功率，將信號通道與參考通道作比值，這樣就可以消除光源不穩定性對實驗結果的影響．

2.2 實驗藥品

糖蛋白檢測實驗所需配制的溶液如下．

磷酸鹽(PBS)緩沖液：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4加去離子水至800 mL，再用鹽酸或NaOH溶液調pH至7.4，用去離子水定容至1 L．

MA-APB溶液：用體積比為1∶1的甲醇和二氯甲烷混合液配制1 mg/mL的MA-APB溶液．

牛血清白蛋白(BSA)溶液：用PBS溶液配制5 mg/mL的BSA溶液．

再生液：乙醇與PBS溶液體積比為3∶1，pH=3．

不同濃度的RNase B溶液：用PBS溶液配制不同濃度的RNase B溶液．

2.3 實驗方法

(1)傳感芯片表面金膜的修飾：將鍍好金膜的傳感芯片浸泡在MA-APB溶液中12 h，利用Au—S共價鍵穩定結合的性質使MA-APB分子緊密結合在金膜表面，形成一層自組裝單分子層．

(2)通入PBS溶液，先角度調制掃描出一條SPR譜線，得出共振峰左側斜率最大值，以此角度為入射角進行定點監測．

(3)BSA封端：MA-APB溶液中還含有少量的MA和APB，那么在金膜表面就會有MA-APB和MA，用BSA封閉少量的MA中的羧基，以免對后續實驗產生干擾．如圖4所示．

圖4 APB固定及其與RNase B結合、再生過程示意圖

Fig.4 APB fixed and combination with RNase B, regeneration process diagram

(4)RNaseB檢測實驗(如圖5所示)：①通PBS緩沖液10min左右至基線平穩．PBS緩沖液的作用是模擬生理環境，為生化反應提供一個穩定的環境．②通入RNaseB樣品15min，使RNaseB與APB特異性結合，得到生長曲線，將最高點作為響應值．③再通入PBS緩沖液10min左右，可以看出曲線有一段回落，這是由于清洗掉物理吸附上去的RNaseB，但回落很少，說明RNaseB與APB結合牢固．④通入再生液，將RNaseB洗脫掉，使傳感芯片表面再生，以便進行重復性測試．⑤最后再通入PBS緩沖液回到基線，完成一個循環．

圖5 RNase B在線監測過程圖

2.4 實驗結果及討論

2.4.1 穩定性測試 圖6為激光器的穩定性測試和加入參考通道后系統的穩定性測試，測試時間為45min，穩定性可用(Pmax-Pmin)/Pavg來計算．

(a) 激光器穩定性測試

(b) 加入參考通道后系統穩定性測試

圖6 穩定性測試

Fig.6 Stability test

通過測試得出，激光器穩定性為1.44%，加入參考通道后系統的穩定性為0.136%．由此可見，加入參考通道后的系統穩定性比未優化系統的穩定性提高了一個數量級，因此系統測量精度也會有所提高．

2.4.2 再生條件探究 洗脫再生對于檢測的準確性、檢測時間以及傳感元件的使用壽命都有很大的影響．本文比較再生液為乙醇與PBS溶液體積比為3∶1，pH分別為5、4、3的洗脫再生效果，如圖7所示．

再生能力是用后面不同pH的響應值與開始pH=3的響應值之比來表示．表1為不同pH的再生液再生能力對比．

從表中可以直觀地看出，pH越小再生效果越好．由于pH=3的再生能力達到97%，已經滿足實驗要求了，所以沒有再配制pH更小的溶液，以pH=3的溶液作為再生液．

圖7 再生曲線

表1 不同pH的再生液再生能力對比表

2.4.3 重復性 重復性[24]是指多次測量某一量時，測定值的離散程度．它反映分析方法或測量系統存在隨機誤差的大小，也是檢驗一臺儀器是否合格的關鍵參數．在相同實驗條件下，進行5次實驗，如圖8(a)所示．將5次的響應值做成柱狀圖，如圖8(b)所示．

數據分析得出5組響應值的標準差為0.010 72，均值為0.279 9，相對標準偏差(RSD)=標準差/均值=3.83%<10%，說明該測試方法具有較好的可重復性和穩定性．

2.4.4 特異性檢測 傳感芯片表面的非特異性吸附是影響SPR傳感器檢測準確性的一個重要因素．由于RNase A與RNase B的結構相似，本文選擇RNase A來做特異性對比實驗，如圖9所示．

從圖中可以看出，RNase A在芯片表面無明顯吸附，而RNase B響應非常明顯，說明固定有3-氨基苯硼酸的芯片對于非特異性吸附非常小，能夠實現對RNase B的特異性檢測．

2.4.5 不同濃度RNase B的檢測 從低到高進行不同濃度RNase B的檢測，得出如圖10的響應曲線圖．

取各曲線的響應值，做線性擬合及殘差分析．因為在通不含RNase B的PBS溶液時傳感器幾乎沒有響應，所以應設置擬合曲線過原點，如圖11所示．

(a) 測量曲線

(b) 響應值柱狀圖

圖8 重復性實驗

Fig.8 Reproducibility experiment

圖9 特異性實驗

圖10 不同濃度RNase B響應圖

圖11 線性擬合與殘差分析

線性擬合關系式為

y=0.354 09x

(1)

相關系數R2=0.957 29．

做多項式擬合及殘差分析，同樣設置擬合曲線過原點，如圖12所示．

圖12 多項式擬合與殘差分析

多項式擬合關系式為

y=-0.268 89x2+0.598 83x

(2)

相關系數R2=0.999 8．

從殘差分析和相關系數結果可知，濃度與歸一化光強更符合多項式擬合，因此以多項式擬合曲線作為RNase B檢測的標準曲線．

3 結 語

本文采用改進的SPR譜儀對糖蛋白進行了特異性檢測，對不同濃度的RNase B進行線性擬合和多項式擬合，說明了濃度與歸一化光強更符合多項式擬合．以多項式擬合曲線作為其標準曲線，也證明了該SPR譜儀使用方便、檢測速度快、結果準確，因此對于生化實驗的分析是一種比較好的儀器．糖蛋白對人體健康具有重要意義，SPR技術對于糖蛋白的檢測具有無須標記、檢測速度快、靈敏度高等優點，將會在醫學方面得到廣泛應用．

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Research on detection of glycoprotein by surface plasmon resonance spectrometer

WANG Jinmei, YU Qingxu*

( School of Physics and Optoelectronic Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China )

A surface plasmon resonance (SPR) biochemical analyzer is introduced. The method of combining angle scanning with intensity modulation is adopted to realize the real-time monitoring of glycoprotein. In the experiments of glycoprotein detection, the renewable solution of pH=3 is chosen because the regenerative capacity of the solution reaches 97% in the renewable solution of different pH comparison. Relative standard deviation (RSD) is 3.83% in the five measurements of the same concentration glycoprotein. The experimental method can detect the specificity of glycoprotein in the comparative experiments of non-glycoprotein and glycoprotein. Finally, the glycoprotein concentration between 0.01 mg/mL and 1 mg/mL is detected. The relationship between the concentration of RNase B and the normalized light intensity is more consistent with polynomial fitting by comparing the residual analysis and correlation coefficients of linear fitting and polynomial fitting, and polynomial fitting curve is used as standard curve. The experimental results show that the SPR spectrometer can detect the specificity of glycoprotein, while will be widely used in medical field.

surface plasmon resonance (SPR); real-time monitoring; glycoprotein; boronic acids

1000-8608(2017)01-0016-07

2016-04-11；

2016-09-30．

王金美(1988-)，女，碩士生，E-mail:891825471@mail.dlut.edu.cn；于清旭*(1955-)，男，教授，E-mail:yuqx@dlut.edu.cn.

TP212

A

10.7511/dllgxb201701003